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1、 CHEM PKU CHEM PKU 稀土荧光探针检测 多巴胺及类似物 答辩人:袁洁 导师:赵美萍 副教授 2003年6月18日 CHEM PKU CHEM PKU n选题背景 n已有检测方法综述 n实验部分 n总结 n致谢 CHEM PKU CHEM PKU 儿茶酚胺的结构 及生理意义 n儿茶酚胺(catecholamine, CA )的种类、结构和生理意义 n神经递质在单细胞检测中的意义 CHEM PKU CHEM PKU Dopamine(DA ) n瑞典神经药理学家Carlsson于1958 年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的 神经递质 n正常值范围为血浆:888pmol/L; 尿:
2、424-2612nmo1/24h。 n增高会引起嗜铬细胞瘤,心肌梗塞 ,糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病 。而其含量的降低会引起植物神经 病变,帕金森病等。 CHEM PKU CHEM PKU Epinephrine(E)& nor epinephrine (NE) 在人体内的正常值 范围为 血浆:480pmo1/L ; 尿:0- 80nmo1/24h 在人体内的正常值范 围为血浆:615- 3240pmol/L; 尿:0 -590 nmol/24h CHEM PKU CHEM PKU 对儿茶酚胺的检测手段 检测方法 灵敏度优点缺点 放射酶学法 2.210 -1 0 M , 灵敏度高 ,选择 性好
3、 技术难 度高 ,检测 速 度慢,危险 HPLC法 depends 分离效果好 ,可 结合不同检测 器 应用 流动相有可能影响检 测效果 荧荧光测测定法 (THI、EDA) 10 10M-10 9 M(改良后) 常规使用,改良后 灵敏度较高 样品处理程序复杂, 特异性不高 电电化学分析 法 10 6M-10 5 M能排除抗坏血酸的 影响,重现性较好 灵敏度低,只是针对 DA检测 ,仍处于实验 研究阶段 毛细细管电电泳 (CE)法 10-8 M( depends) 分离高效,耗样量 少 灵敏度尚不高 稀土荧荧光探 针针法 10-8 M简便,可以与各种 分离手段联用 灵敏度不够高 CHEM PKU
4、 CHEM PKU 稀土荧光探针检测 儿茶酚类化合物的原理 单纯的TbCl3,Tb-DCTA体系和DOPAC 在实验用的波长条件下 (298nm,546.8nm)都没有荧光信号,可 见体系发光是由于形成了Tb-DCTA DOPAC三重络合物并发生了能量转移得 结果。 CHEM PKU CHEM PKU DOPAC的荧光图 红:激发波长为279nm 蓝:激发波长为298nm TbCl3的荧光图 红:激发波长为298nm 蓝:激发波长为240nm CHEM PKU CHEM PKU TbDCTA荧光图 玫红:激发波长为240nm 绿:激发波长为240nm(三 重络合物,TbDCTA浓度 同上) 绿
5、:激发波长为298nm TbDCTADOPAC 体系荧光图 绿:激发波长为240nm 红:激发波长为279nm 蓝:激发波长为298nm CHEM PKU CHEM PKU 1.三元络合物的形成 三元络合物体系: 1.离子缔合三元络合物 2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合 物 TbDCTACAs体系: Tb与DCTA先行络合,然后Tb余下的空位再 与CAs络合,形成三重络合体系 CHEM PKU CHEM PKU 2.三元络合物发光机理(1) 配体受激后,单重态(S1)有三种方式退激 : a. 产生荧光的辐射跃迁(S1-S0) b. 系间窜跃(S1-T1) c. 无辐射跃迁回基态(ISC
6、) 三重态(T 1)也有三种退激方式: a. 产生磷光的辐射跃迁(T1-S0) b. 通过无辐射转移跃迁到Tb3的激发态(ET) ,c. 无辐射跃迁回基态(T1S0)。 CHEM PKU CHEM PKU 2.三元络合物发光机理(2) 分子内能量转换效率的影响因素: 1.配体最低的激发三重态(T1)能量高于Tb的 5D 4能级的能量 2.能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率 3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和 几率相当高 CHEM PKU CHEM PKU 2.三元络合物发光机理(3) 儿茶酚胺的磷光发射波长在409 nm 417 nm,亦即其三重态(T1)的能量高 于Tb3的5
7、D 4能级约3800-4000 cm 1 高量子产率和跃迁几率 能量转移速率常数高达1010s1 由水或解离的氧导致的配体三重态(T1 )以及Tb3, 发光的猝灭也大大减少了 。 CHEM PKU CHEM PKU 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择: 1. Eu3 + EDTA体系 ; 2. Eu3phen体系; 小结: 最终弃用这两个体系的原因,是其适用 的pH范围太低,难以使DA的羟基充分解 离形成三元络合物。 CHEM PKU CHEM PKU 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择: 3. Tb3 + EDTA体系(1): Tb:EDTA1:1(浓度均为2 mmol/L),
8、pH11, ex300 nm,em545 nm,加入甲醇( 分析纯)、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意 检测限,DA为105 mol/L 小结: 目前研究最多的体系,适用的pH相对于前两个体系有 了很大提高,但是仍然未能达到文献报道的结果 CHEM PKU CHEM PKU 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择: 3. Tb3 + EDTA体系(2): Tb:EDTA1:1(浓度均为2 mmol/L), pH11, ex240 nm,em545 nm,出现递减结果 小结: 在ex240 nm,em545 nm,出现的Tb3特征波长 处的递减结果,可能是由于在检测条件下,TbEDT
9、A 体系能发出Tb3的特征荧光,而待测物与之形成三重 络合体系后,激发波长红移,亦即三重络合体系的形成 导致了一部分Tb3特征荧光的猝灭。 CHEM PKU CHEM PKU ACDOPACFluro图 BCDA-Fluro图 CHEM PKU CHEM PKU 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择: 4. Tb3 + DCTA体系 : 20C 时, Tb3与EDTA的络合常数lgK1 为17.93,而与DCTA的络合常数lgK1为 20.20* 因此本体系可以在更高pH下存在,更利 于三重络合物形成 CHEM PKU CHEM PKU pH影响 0.4 mmol/L Tb3 DCTA,2
10、105 mol/L DOPAC,横 坐标为pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA,410 5 mol/L DOPAC溶液(色谱 纯甲醇:重蒸水9:1), 横坐标为5 ml样品中10 mol/L NaOH的体积 CHEM PKU CHEM PKU 表面活性剂的影响 由于水分子对荧光有相当的猝灭作用,体系又 是在水相中,因此尝试加入表面活性剂进行改 进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形 成的胶束中得到保护,起到敏化作用。 共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸 钠,阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和 非离子表面活性剂TOPO。都未起到期望的对 体系的改善作用。 CHEM PKU CHE
11、M PKU 甲醇含量影响 0.2 mmol/L Tb3DCTA ,4105 mol/L DOPAC 溶液 ,NaOH fixed CHEM PKU CHEM PKU 重原子影响 重原子对于荧光体系 有时也可起到敏化作 用。实验尝试向体系 加入了SrCl2,BaCl2 ,以及CsCl,其中 CsCl的加入对体系的 荧光有明显得增强作 用 ,最后选择CsCl 浓度为0.1 mol/L。 CHEM PKU CHEM PKU 加样顺序影响 TbDCTA, 甲醇, NaOH, CsCl TbDCTA, 甲醇, CsCl, NaOH TbDCTA, NaOH,甲醇, CsCl TbDCTA, NaOH,
12、CsCl,甲醇 Tb,DCTA, 甲醇, NaOH, CsCl DCTA, 甲醇, Tb,NaOH, CsCl CHEM PKU CHEM PKU 实验操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA 溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色谱纯 甲醇4.5 ml,混匀。在检测前再加入待测 物,用重蒸水定容至5 ml,在激发波长 为298 nm,发射波长546.8 nm处用0.5 cm比色池测定荧光强度。 CHEM PKU CHEM PKU 实验结果 a. CDA Fluro图 b. CDOPAC- Fluro图 CHE
13、M PKU CHEM PKU 实验结果 c. C邻二酚 Fluro图 d. C3,4二羟基苯甲酸Fluro图 CHEM PKU CHEM PKU 实验结果 被测物 指标 多巴胺( DA) 3,4二羟 基苯乙酸 (DOPAC ) 邻二酚( 儿茶酚) 3,4二 羟基苯 甲酸 线性范围 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 线性相关 系数 0.99880.99920.99670.9982 检测限5.2108 mol/L 3.6108 mol/L 5.7108 mol/L 2.9710 8 mol/L CHEM PKU CHEM PKU 1.证明了CAs 能够与Tb 和另一配体形成三重络 合物并发出荧光。 2. 建立了一个新的用稀土荧光探针检测儿茶酚类 化合物的体系,并对实验条件进行了优化。 3. 确定了新方法检测四种物质的线性范围和最低 检出限。 下一步工作:可以与分离技术联用,用于检测 细胞、体液及组织样品中的儿茶酚类物质。 总 结 和 展 望 CHEM PKU CHEM PKU 致 谢 赵美萍,常文保,赵金富,程智勇, 石志红,何建涛,裴剑,姚婷婷 等诸位老师和同学在我做毕业论文期间 给我的细致的指导,积极的建议和热情 的帮助。