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1、基于冷冻电子显微镜学的生物大分子的高时空分辨率的结构和功能研究 项目名称：基于冷冻电子显微镜学的生物大分子的高时空分辨率的结构和功能研究高海啸 清华大学2010年1月-2014年8月教育部:课题一，高通量、全自动化的冷冻电镜数据采集和三维重构图像处理方法的研究开发高通量、全自动化的电镜数据采集和处理方法, 以及高性能的三维重构算法 在冷冻电镜结构解析工作中，目前有相当大的一部分时间和人工都消耗在重复性工作中，例如电镜胶片的拍摄和扫描，电镜图像的预筛选，三维重构计算中的某些步骤等。近年来，随着冷冻电子显微学的蓬勃发展，可以达到的分辨率越来越高，相应地对电镜数据量的需求也越来越大。以核糖体结构解析
2、为例，获得10?分辨率的核糖体结构需要10万个冷冻电镜单颗粒。而在理论上，获得原子分辨率（好于3?）则至少需要100万个单颗粒电镜图像。如果以目前普遍使用的手动方式来进行数据采集和处理，那么仅仅电镜胶片的拍摄、扫描，以及电镜图像的预筛选等工作就需要数月之久！这实际上已经成为阻碍当前高分辨率的冷冻电镜结构解析的主要瓶颈之一。解决这一问题的有效途径就是开发高通量、全自动化的电镜数据采集和处理方法以及高性能的三维重构算法，以最大程度地提高对超大电镜数据量的采集和处理的效率，减少在这些方面耗费的人工和时间。自动化的电镜数据采集系统对电镜的稳定性和计算机控制下的可操作性要求很高。特别是开发基于单颗粒重构
3、方法的自动化采集系统，要求能够自动识别大量的适合成像的样品区域并长时间持续监控。由于开发难度很高，目前国际上在这一前沿领域的工作才刚刚开始，而真正能够实现全自动化数据采集的系统更是屈指可数。由本项目研究人员雷建林教授在过去数年中主持开发的AutoEMation是其中的佼佼者。与传统的手工采集方法相比，AutoEMation的巨大优势是能够对单个样品进行长达数日甚至数周的持续数据采集。以多输出通道的4kx4k CCD相机为例，24小时内可至少收集2000张电镜照片，比手工采集效率高十倍以上。此外，AutoEMation还能自动地在低电子辐照剂量下根据样品情况选择在同一个孔洞中的不同区域多次拍摄，
4、从而大大提高了样品的利用率。而这在手工电镜数据采集中是无法做到的。AutoEMation目前已经在哥伦比亚大学、德州大学休斯顿医学中心、哈佛大学等多家冷冻电镜研究机构全面运转或试运转，并已多次稳定地对单个样品进行数据采集一周以上，迄今共收集十余万张CCD照片。在本课题中，我们将在AutoEMation现有的核心构架的基础上，开发一套完备的高通量和全自动化的电镜数据采集和处理系统。首先，针对目前AutoEMation还只能运行在美国FEI公司的Tecnai系列冷冻电镜上的限制，将其扩展到我们刚刚在清华大学和中科院生物物理所购置的Titan Krios冷冻电镜平台上。需要指出的是，目前还没有任何针
5、对Titan Krios冷冻电镜的自动化数据采集系统。我们在这方面的工作将是国际上最前沿的。其次，将AutoEMation扩展至具有支持单颗粒采集，倾转系列数据采集（包括电子断层分析和单颗粒倾转）等多项重要冷冻电镜操作功能。最后，在自动化数据采集的基础上，实现对电镜数据的预处理、预筛选，并由此探索和优化电镜样品的理想处理和数据收集条件，如包埋冰层的最佳厚度、电子束的最佳辐照强度和最佳欠焦范围等。 冷冻电镜图像的三维重构有很高的计算需求，特别是其中alignment和refinement的计算部。在10年前，这些计算任务主要是在具有共享内存架构和多处理器的专用计算机上完成。随着对分辨率的要求越来
6、越高，所需要处理的电镜图像的数量呈指数增长趋势。因此，过去那种依赖于昂贵的专用计算机的数据处理方式已不再可行，而需要采用以LINUX为操作系统的计算机集群。在本课题中，我们将会针对高性能并行化这一需求对相关三维重构算法进行优化。以目前在国际冷冻电镜领域应用最广泛的三维重构系统SPIDER（System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields ）为核心，开发自动化的电镜数据处理系统。并将利用数据库集中管理从样品制备、电镜数据采集、数据分析、一直到三维重构的全套过程，以实现对一个完整的电镜结构解析项
7、目的高效管理和处理。开发和优化结构不均一性存在条件下的高性能分类方法，并应用于研究生物大分子复合体的动态过程和功能 结构不均一性是指由于生物大分子复合体自身结构的内在灵活性，在采集到的同一组冷冻电镜数据中经常包含着它们不同的结构构象。目前，结构不均一性影响冷冻电镜结构的分辨率已是一个普遍存在的问题。这主要是由于生物大分子复合体往往有多个与功能相关的结构共存，通过实验手段很难将它们分离。因而在采集到的冷冻电镜照片中，不同的单颗粒可能代表不同的功能态结构，它们之间结构的差异将直接降低三维重构密度图的分辨率。在严重情况下，甚至会导致局部密度图残缺。 当前，冷冻电子显微学领域的一个重要研究热点就是针对
8、结构不均一性的成熟的、普适的分类方法的研发。利用冷冻电镜数据中丰富的内在结构信息，将存在结构不均一性的冷冻电镜数据在三维重构前进行分类。目前采用的分类方法主要分为两类，即监督性方法和非监督性方法。前者的特点是快速、简便，但是必须引入合适的参考结构（reference volume）。分类结果的优劣往往取决于参考结构选取的好坏。在冷冻电子显微学领域，现有的分类方法的研究工作大都属于这一类，主要是基于交叉关联函数的监督性分类方法。由于监督性分类方法对预先引入的参照结构要求较高，在使用不当的情况下常常会导致分类后的结构出现偏差甚至错误，因此开发有效的非监督性分类方法来解决冷冻电镜中的生物大分子结构不
9、均一性尤为重要。然而，由于冷冻电镜数据的信噪比极低，加之采集到的电镜照片中的单颗粒的投影方向有待确定，使得分类问题变得非常复杂。目前，针对非监督性分类方法的研究工作大多还只是在尝试阶段。其中，由本课题负责人高海啸教授参与开发的基于最大似然法的分类方法，是目前唯一一个在实践中得到运用的非监督性分类方法。在本课题中，我们将在过去的分类方法的研究工作基础上，针对性地选择具体的生物大分子复合体作为研究体系，通过提高和完善现有的监督性和非监督性方法的独立性和普适性，包括改善已有监督性方法对参照对象的过度依赖，建立有效的分类检验算法等，进一步尝试开发全新高效的冷冻电镜数据分类方法。课题二，低对称或非对称性
10、的生物大分子复合体的高分辨结构及其动态过程的研究细胞中所有的重大生命过程都离不开生物大分子的参与。生物大分子发挥功能需要其它生物分子的协同作用，形成稳定的或者不稳定过渡态的复合体。这些大分子复合体通常都处于一个动态的变化过程，为它们的高分辨结构的解析带来了很大困难。本课题将在课题一的基础之上，利用单颗粒重构技术解析几类与重大生命过程相关的生物大分子复合体的高分辨结构，包括一些细胞内可溶的大分子复合体（如核糖体）、膜蛋白或者与膜相关联的蛋白、以及与人类疾病和健康密切相关的细胞膜上受体与配基复合物（如细胞因子/受体复合物）。细胞内可溶性生物大分子复合体（核糖体等）的结构和功能的研究冷冻电子显微学在
11、分子机器的研究中已经应用得非常广泛。以DNA到蛋白质的过程为例，从DNA的复制、转录、mRNA的剪切、以至蛋白质的合成这一系列连续的遗传信息传递过程中，冷冻电子显微学都有着重要的贡献。例如，真核细胞的DNA Polymerase epsilon complex 和MCM helicase，transcriptional complex，spliceosome，都已经有中等分辨率（1-3nm）的冷冻电镜结构。我们将会以核糖体的高分辨功能态结构为重点，同时展开对细胞中其它的一些重要分子机器的结构解析，如蛋白酶体和各种分子伴侣复合体等。 自2000年核糖体的大小亚基分别被解析以来，在过去的十年中，核
12、糖体的晶体学研究取得了巨大的进展。迄今已经有E.coli和 T. thermophilus的两个原子分辨率的70S核糖体被解析。尽管这些晶体结构提供了丰富的核糖体结构信息，目前对详细的蛋白合成分子机理却仍未完全清楚。这主要是由于蛋白质翻译是一个高度动态的过程，每一步都有许多蛋白翻译因子参与并与核糖体相互作用。迄今为止，只有RF1、RF2和RRF这三个因子和核糖体所形成的复合体的晶体结构被解析。与之形成对照的是，冷冻电子显微学已经成功解析出原核细胞的核糖体和所有翻译因子形成的各种复合体的三维结构，其中分辨率最高的已达到6.7?。这些冷冻电镜结构不仅大大地丰富了我们对蛋白合成的动态过程的理解，而且
13、通过将核糖体高分辨的晶体结构“嵌入”到这些不同功能态下的电镜三维重构图中，还可以构建出一系列准原子分辨率的功能态结构模型。我们拟从以下几个方面开展针对核糖体的结构和功能的研究：（1）建立一个高效的、受控的核糖体体外转录体系。分离纯化核糖体的大小亚基以及所有翻译因子，在体外模拟体内的翻译过程，精确控制核糖体复合体停留在指定的功能态，为下一步的冷冻电镜结构解析提供优质样品。并在这一系统的基础上，采用生物化学的方法研究蛋白翻译过程中几个悬而未决的问题，比如在延伸过程中，EF-G是如何促进核糖体上的构象变化；GTP水解的作用到底是什么等。（2）核糖体的多种功能态的高分辨结构解析。在课题一的研究基础上，
14、采用高通量的冷冻电镜方法，解析高分辨率的核糖体的多种功能态结构，然后通过分子动力学手段，构建准原子分辨率的各种功能态模型，从而揭示蛋白质翻译步骤中的分子机理。（3）核糖体的生物起源过程的相关功能和结构研究，如原核生物核糖体的组装过程中的一系列的酶催化反应。在这些反应中，大小亚基前体中的rRNA被修剪和修饰。我们将在体外构建包含这些酶因子（如RimM, RbfA, Era, Obg, Der 以及 YlqF等）的核糖体复合体，解析它们的三维结构，从而了解这些酶和核糖体亚基之间的相互作用，并根据获得的三维信息，进一步设计生物实验，以深入开展相关的功能性研究。膜蛋白复合体的结构和功能的研究人类的很多
15、重大疾病包括神经系统疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病等都和膜蛋白密切相关。对膜蛋白的结构和功能的深入研究是我们进一步了解这些疾病的分子成因以及设计针对性药物的基础。迄今为止，只有大约300多个膜蛋白的结构被解析，还远不到已知蛋白质数据库中收录中所有结构的1%。膜蛋白及其复合体三维结构的解析，以及其结构与功能关系的研究是目前蛋白质科学研究的难题和热点。X-射线晶体学仍然是获得高分辨率的膜蛋白三维结构的主要手段。然而，多数膜蛋白是以复合体的形式发挥功能，由嵌入膜内的疏水部分（或者亚基）和伸在膜外的亲水部分（或亚基）组成兼性蛋白复合体，如数量众多的跨膜转运蛋白复合体、膜蛋白受体、核膜上的核孔复合体等。
16、这些膜蛋白复合体一般是由几个或者几十个蛋白组成，而且在执行功能的时候寡聚结构状态可能发生改变。尽管膜蛋白复合体的局部结构可以通过X-射线晶体学的方法得到，但是其整体组装和动态的结构变化，却需要借助独具手段的单颗粒冷冻电子显微学来进行研究。国际上综合运用X-射线晶体学与单颗粒冷冻电镜技术研究膜蛋白复合体的工作也刚刚开始开展，例如对细胞因子IL-6与膜上受体复合物的研究。 我们拟从以下三个方面开展工作：（1）针对样品制备、电镜图像处理以及图像筛选等方面，开展膜蛋白复合体的单颗粒三维重构的方法学研究。（2）细胞膜上受体与配基复合物的结构和功能的研究。我们将结合单颗粒冷冻电子显微学及X-射线晶体学技术，以白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族细胞因子与受体复合物为目标，开展结构解析以及结构与功能关系的研究工作。目前为止，已发现的白细胞介素-1家族分子有11个，其中研究最为深入
