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1、 分类号： 密级： U D C ： 编号： 学 位 论 文 产气荚膜梭菌 、 毒素突变体构建及应用 Construction of Mutants of Clostridium perfringens Alpha, Epsilon Toxins and its Application 李箐 指导教师姓名 王景林 研究员 申请学位级别 硕士 专 业 名 称 微生物学 提交论文日期 2013.5.20 论文答辩日期 2013.5.24 学位授予单位和日期 安徽医科大学 答辩委员会主席 评 阅 人 2013 年 05 月 安徽医科大学硕士学位论文 产气荚膜梭菌 、 毒素突变体构建及应用 Constr
2、uction of Mutants of Clostridium perfringens Alpha, Epsilon Toxins and its Application 姓 名： 李 箐 指导老师： 王景林 研究员 学 科： 微生物学 论文完成时间： 2013.5.15 论文答辩日期： 2013.5.24 安徽医科大学 2. PCR amplification of pTIG-mETXS111H; 3. PCR amplification of pTIG-mETXS111Y; 4. PCR amplification of pTIG-mETXF199H; 5. PCR amplificat
3、ion of pTIG-mETXF199E; 6. PCR amplification of pTIG-mETXS111YF199E; M. DL2000 DNA marker. 1000 M 1 2000 750 500 250 100 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 M 500 bp 2000 1000 750 250 100 安徽医科大学硕士学位论文 18 经过测序验证，将突变体 mETXH106P， mETXS111H， mETXS111Y， mETXF199H， mETXF199E， mETXS111YF199E基因序列与 ETX 的基因序列比对，各突变体分别将第 106 位组
4、氨酸（H）突变成脯氨酸（P） ，第 111 位丝氨酸（S）突变成组氨酸（H）或酪氨酸 （Y） ，第 199 位苯丙氨酸（F）突变成组氨酸（H）或谷氨酸（E） ，其中 mETXS111YF199E 共涉及 111 位丝氨酸与 199 位苯丙氨酸两个位点的突变。序列比对结果略。 2.3 突变体 mETX 蛋白的诱导表达 为了获得可溶性表达的 mETX，在 0.5 mM IPTG 于 16诱导过夜的诱导条件下， SDS-PAGE 电泳结果显示， 菌株 BL21(DE3)/pTIG-mETX 超声破碎后上清 （可溶性部分） 及沉淀（包涵体部分）中均有目的蛋白的表达，其中 BL21(DE3)/pTIG-
5、mETXH106P可溶 性表达量较低，鉴于包涵体表达部分为蛋白质错误折叠所得且无生物学活性，所以选择 其可溶性部分进行纯化。图 1.3 所示为突变体蛋白诱导表达 SDS-PAGE 蛋白电泳图谱。 图 1.3 SDS-PAGE 鉴定 mETX 诱导表达前后各阶段样品 （A.1.mETXS111H诱导前全菌蛋白；2.诱导 后全菌蛋白；3.诱导后超声破碎上清；4.诱导后超声破碎沉淀；5. mETXF199H诱导前全菌蛋白；6. 诱 导后全菌蛋白；7.诱导后超声破碎上清；8.诱导后超声破碎沉淀； B.1. mETXS111YF199E诱导后全菌蛋 34kDa 34kDa 80 1 2 M kDa 40
6、 30 20 12 60 34kDa 60 kDa 80 40 30 20 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 kDa 80 60 40 30 20 12 安徽医科大学硕士学位论文 19 白；2.诱导后超声破碎后上清；3.诱导后超声破碎沉淀；4. mETXS111Y诱导后全菌蛋白；5.诱导后超 声破碎后上清；6.诱导后超声破碎沉淀；7. mETXF199E诱导后全菌蛋白；8.诱导后超声破碎后上清； 9.诱导后超声破碎沉淀； C.1. mETXH106P诱导后超声破碎后沉淀；2.诱导后超声破碎后上清） Fig 1.3 SDS-PAGE analysi
7、s of mETX at different stages of induce (M. low molecular weight protein marker; A. 1.un-induced E.coli cell of mETXS111H; 2. E.coli cell after induced with IPTG; 3.the supernatant after ultrasonication of the induced E.coli cell; 4.the cell debris after ultrasonic and centrifugation; 5.un-induced E
8、.coli cell of mETXF199H; 6. E.coli cell after induced with IPTG; 7.the supernatant after ultrasonication of the induced E.coli cell; 8.the cell debris after ultrasonic and centrifugation; B. 1. E.coli cell strain contains mETXS111YF199E after induced with IPTG; 2. the supernatant after ultrasonicati
9、on of the induced E.coli cell; 3. the cell debris after ultrasonic and centrifugation; 4. E.coli cell strain contains mETXS111Y after induced with IPTG; 5. the supernatant after ultrasonication of the induced E.coli cell; 6. the cell debris after ultrasonic and centrifugation; 7. E.coli cell strain
10、contains mETXF199E after induced with IPTG; 8. the supernatant after ultrasonication of the induced E.coli cell; 9. the cell debris after ultrasonic and centrifugation; C. 1. the cell debris after ultrasonic and centrifugation of E.coli cell strain contains mETXH106P; 2. the supernatant after ultras
11、onication) 2.4 突变体 mETX 蛋白的纯化及含量测定 BL21（DE3）/pTIG-mETX 工程表达菌株的可溶性表达部分经 Ni-NTA 亲和层析柱 进行纯化，mETXH106P， mETXS111H， mETXS111Y， mETXF199H， mETXF199E， mETXS111YF199E分别在含约 72mM，48mM，68mM，48mM，220mM，212mM 咪唑浓度 的洗脱液中被洗脱下来，图 1.4（A）所示为 mETXF199E纯化图谱，其他突变体纯化图谱 略。 图 1.4 mETX 突变体亲和层析图谱与 SDS-PAGE 电泳图谱 Fig 1.4 Affin
12、ity chromatographic profile and SDS-PAGE of mETX. (A) Purification of mETXF199E using 安徽医科大学硕士学位论文 20 a Ni2+-cheating HP column. The mETXF199E was eluted with buffer containing increasing concentrations of imidazole up to 500 mM (the arrow marking fraction). The purification data of other mETXs have
13、 not shown. (B) 12% SDS-PAGE analysis of purified rETX and its mutants. Lane 1-6, mETXH106P; mETXS111Y, mETXS111H, mETXF199H, mETXF199E, mETXS111YF199E; Lane 7, rETX; Lane M, ProteinRuler protein marker (TransGen Biotech, China). 图 1.4（B）所示为六种突变体 mETX 蛋白纯化行 SDS-PAGE 电泳图谱，其均可达 到电泳纯。选择纯化后纯度较高的突变体蛋白收集液
14、置于 0.01M PBS 中透析至平衡，后 加 PEG20000 浓缩至理想体积，用 BCA 法进行蛋白定量，以 BSA 标准蛋白绘制标准曲 线见图 1.5， 得公式 Y=0.876X-0.0037， 其 R2值大于 0.99， 公式可用于蛋白浓度的计算。 经计算， 突变体蛋白 mETXH106P， mETXS111H， mETXS111Y， mETXF199H， mETXF199E， mETXS111YF199E浓度分别为 0.285mg/ml，0.408mg/ml，0.154mg/ml，0.356mg/ml， 1.349mg/ml，2.22mg/ml。 图 1.5 BCA 法定量突变体蛋白
15、标准曲线 Fig 1.5 standard curve of BCA assay 2.5 突变体 mETX 抗原性分析 间接 ELISA 结果表明， 与未突变的 rETX 相比， 除了 mETXH106P效价为 1： 102之外， 其他突变体及 rETX 效价均可达到 1:103，说明各突变体均可被抗 rETX 鼠单克隆抗体所 识别，具有良好的抗原性。免疫印迹结果见图 1.6，图中可见在 30-40kDa 之间有特异性 条带，说明突变体蛋白可与抗 rETX 鼠单克隆抗体特异性结合，证明突变后 mETX 在原 核表达系统中可正确表达，且抗原性良好。 y = 0.876x - 0.0037 R =
16、 0.9966 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 00.20.40.6 标准蛋白浓度（mg/ml） A562吸光值 标准曲线标准曲线 标准曲线 线性 (标准曲线) 安徽医科大学硕士学位论文 21 图 1.6 免疫印迹法分析突变体 mETX 抗原性 Fig 1.6 Western blotting of purified rETX and its mutants with monoclonal mouse anti-rETX antibody detected using Super-ECL horseradish peroxidase. Lane 1-6, mETXH106P; mETXS111Y, mETXS111H, mETXF199H, mETXF199E, mETXS111YF199E; Lane 7, rETX. The pre-stained protein marker (TransGen Biotech, China) is indicated on the right side of th
