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1、中国医科大学 博士学位论文 羟丁酸钠对新生大鼠缺氧缺血性脑损害的保护作用及其机制 姓名：马正良 申请学位级别：博士 专业：麻醉学 指导教师：曾因明 20040401 中文摘要 目的 缺氧缺血性脑损害( H y p o x i c i s c h e m i cb r a i nd a m a g e ，H I B D ) 在临床上， 尤其围产期，是危及新生儿生命和导致婴儿和儿童期神经损伤的的主要原 因。尽管有关防治的研究颇多，但目前仍未取得明显突破。随着对H I B D 发病机制的进一步认识，中枢兴奋性氨基酸及抑制性氨基酸的平衡失调与 H I B D 的关系也愈来愈受到重视。羟丁酸钠( s o
2、 d i u mh y d r o x y b u t y r a t e ，G H B ) 是抑制性神经递质1 一氨基丁酸( G A B A ) 的中间代谢产物1 一羟基丁酸的钠 盐，是G A B A 的类似物，具有明显的中枢抑制作用。本实验室研究最近发 现G H B 对沙土鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用，提示其可能 对新生大鼠H I B D 有脑保护的作用。本研究采用新生7 d 大鼠H I B D 模型， 通过观察动物生长发育、脑病理形态学、学习记忆能力、皮层和海马C A l 区 凋亡相关蛋白B c l - 2 、B a x 的表达、凋亡细胞计数、海马兴奋性氨基酸N - 甲基 -
3、 D - 天冬氨酸受体( N m e t h y l D - A s p a r t a t er e c e p t o r ，N M D A R ) 亚单位N R l 、 N R 2 A 、N R 2 Bm R N A 表达的变化，从多个层面探讨羟丁酸钠对H I B D 的脑保 护作用及其机制，为临床防治H I B D 提供新的方法和理论依据。 材料和方法 1 H I B D 模型的制作、动物分组、给药 1 1 H I B D 模型的制作参照R i c e 法，将新生7 dS D 大鼠乙醚麻醉后 颈部正中切开皮肤，游离左侧颈总动脉并于结扎后2 3 h 吸入8 O ：、9 2 N ：的混合气
4、体，持续2 h 。假手术组仅作颈部切开和左颈总动脉分离术，不 结扎和吸低氧气体。 1 2 动物分组和给药方法大鼠随机分为假手术组( S 组) 、生理盐水 对照组( C 组) 和G H B 组( 各组) ，1 各组按所用G H B 剂量不同，进一步分 为1 1 、啦和1 3 组。每组按术后观察时间点不同进一步分为各亚组。C 组 缺血缺氧( h y p o x i a - i s c h e m i a ，H I ) 后即刻腹腔注射( i p ) 生理盐水，容积为 0 2 m l 1 0 9 ，每日3 次；s 组术后4 hi p 给药生理盐水，用置和用法同C 组；T 1 1 组、嵋组和印组分别i
5、p 用生理盐水稀释的G H B5 0 、1 0 0 和2 0 0 m g k g ，用法 和容量同C 组。 2 H I 对新生大鼠脑组织形态学、生长发育和学习记忆能力的影响及 G H B 的干预作用 2 1 动物分组给药按1 2 段描述进行动物分组和给药，按H I 后 3 d 、7 d 、1 4 d 和2 8 d 进一步分为4 个亚组，每组2 0 只。 2 2 观察指标及测定方法 2 2 1 生长发育体重、身长的增长倍数。 2 2 2 存活率的观察新生大鼠H I 后2 8 d 内各组动物的存活率 2 2 3 学习记忆能力的测定H I 后2 7 d 用Y 迷宫法首次测定各组学 习记忆能力，2 4
6、 h 后第二次测定。观察指标如下：( 1 ) 达标率；( 2 ) 达标前所 需反应次数；( 3 ) 总反应运动时间；( 4 ) 主动回避反应率；( 5 ) 正确反应率。 2 2 。4 左大脑半球萎缩程度、空洞发生率和含水率的测定在各观察 时间点随机选择各组存活大鼠8 只，将动物断头处死后取出脑组织观察大 体形态学变化。然后正中切开左、右大脑半球，称湿重后置入7 0 一8 0 烤箱2 4 h ，再称干重。左大脑萎缩程度用左右大脑半球湿重表示；大脑含 水率= ( 湿重一干重) 湿重。 2 2 。5 左侧海马C A l 区锥体神经元病理形态学观察各组全部剩余 存活大鼠，用4 多聚甲醛灌注后取脑，石蜡
7、包埋，连续切片，按序间隔留 片，并分别贴片后取其中I 一套。I 套行苏木精伊红( r m ) 染色后在光 镜下观察细胞形态学的变化。一留作免疫组化和T U N E L 染色，剩余切 片备用。 结合2 2 4 和2 2 5 实验中的观察结果，计算H I 后2 8 d 各组大鼠左侧 大脑半球空洞发生率。 3 m 对新生大鼠左侧大脑皮层和海马C A I 区锥体神经元B e l - 2 、B a x 蛋白表达及细胞凋亡的影响及G H B 的干预作用 3 1 动物分组和给药方法 新生大鼠按1 2 段所述进行实验分组及给药，各组按m 后1 h 、3 h 、l d 、 3 d 、7 d 进一步分为5 个亚组
8、，每组随机选择存活大鼠6 只。 3 2 观察指标和测定方法 3 2 1 左侧大脑皮层和海马C A l 区锥体神经元B c l - 2 、B s x 蛋白表达 各时间点各组大鼠使用4 多聚甲醛灌注后取脑组织常规固定后石蜡 2 包埋，连续切片，按序间隔留片，并分别贴片。取其中I 套，其他切片备 用。 、套切片用免疫组化法染色后在光镜下分别观测左侧大脑皮层和 海马C A l 区锥体神经元B c l - 2 、B a x 蛋白表达。 3 。2 2 左侧大脑皮层和海马C A l 区锥体神经元凋亡计数 第套切片作T U N E L 染色，在光镜下计算凋亡细胞数。 4 缺血缺氧对海马N R l 、N R 2
9、 A 、N R 2 Bm R N A 表达的影响及G H B 的干 预 4 1 动物分组和给药方法 新生大鼠按1 2 段所述进行实验分组及给药。各组按H l 后2 h 、6 h 、 1 2 h 、l d 、3 d 和7 d 进一步分为6 个亚组，每组取存活大鼠6 只。 4 2 左侧海马N R l 、N R 2 A 、N R 2 B 基因表达的监测 将新生大鼠在m 后2 h 、6 h 、1 2 h 、1 d 、3 d 及7 d 断头处死，取左侧海马组 织约2 5 m g ，参照P r o m e g a 公司提供的T o t a lR N A I s o l a t i o nS y s t e
10、 m 和A c c e s s R T P C Rs y s t e m 试剂盒说明进行R T - P C R 试验。取P C R 产物通过1 琼脂 糖凝胶( 含溴乙锭) ，在8 0 m A 恒流下电泳约3 0 m i n 后用图象分析软件半定 量分析N R l 、N R 2 A 、N R 2 B 基因表达量。 5 统计学处理 所有计量资料数据以均数标准差( i S ) 表示，用L o g r a n k 检验比较 存活率，用x 2 检验比较大脑半球空洞坏死率和达标率。其余指标组内比较 用配对t 检验，组问比较用单因素方差分析法( O n e W a y A N O V E ) ，P 0 0
11、5 认为有显著差异。用S P S S l l 0 软件作统计学处理。 结果 1 G l I B 对H I 后新生大鼠生长发育及海马C A l 区锥体神经元形态学 的影响 1 1 各组新生H I 后大鼠生长发育的比较 H I 后3 d 、7 d 、1 4 d 和2 8 d ，C 组大鼠体重和身长的增长明显小于S 组 ( P 0 0 5 ) 。l 后2 8 d ，C 组和1 1 组大鼠m 后2 8 d 左、右大脑半球湿重之比值显著小于1 2 、1 3 ( P 0 0 5 ) 。在H I 后3 h 皮层和海马C A l 区的表达仍与 H I 后l h 相似。在H I 后l d ，B a x 的变化也
12、与B c l - 2 相似，达到高峰。皮层的 灰度值在c 组和7 各组明显离子s 组( P 0 0 5 ) ，但C 组下降幅度较 小。见表1 2 ，图3 5 4 0 表1 2H I 后各组大鼠左侧海马N R Im R _ N A 表达的比较( n = 6 ，i 8 ) 2 h6 h1 2 hl d3 d7 d P O 0 5 ；一P 0 0 1 与C 组比较。 在H I 后2 h 、6 h 、1 2 h 和1 d ，C 组N R 2 Am R N A 表达逐渐下降，明显低于 同时刻S 组和1 各组( P 0 0 1 ) 。m 后3 d ，表达已开始回升，但仍然显著 低于S 、1 l 和1 2
13、组( P 0 0 5 ) 。 与s 组相比， 1 组在m 后6 h 、l d 显著增高( P O 0 5 ) ，在H I 后1 2 h 和3 d 极显著增高( P O 0 1 ) ；啦组在H I 后2 h 和1 2 h 也明显增高，有极显著差异 ( P 0 0 5 ) ； r 3 组在H I 后2 h 和6 h 也极显著和显著高于s 组( P 0 0 1 和P 0 0 5 ) 。各1 各组之间N R 2 Am R N A 表达也不平衡，在m 后2 h 和3 d ，1 1 组 3 1 显著低于1 2 和妒组( P 0 0 5 ) ；H I 后6 h ，1 l 和啦组显著低于组( P 0 0 5
14、) ；H I 后1 2 h ，“ y l 和7 2 组极显著地高于组( P 0 0 1 ) ；H I 后l d ，3 , 2 和印组与1 1 组相比有显著( P 0 0 5 ) 或极显著差异( P 0 0 1 ) 。见表1 3 ， 图4 1 4 6 。 表1 3H I 后各组大鼠左侧海马N R 2 Am R N A 表达的比较( n = 6 ，i s ) 2 h 6 h 1 2 hl d3 d7 d S 0 9 7 0 1 3 0 9 9 0 2 0 1 0 7 0 0 7 1 0 7 0 0 5 1 1 6 01 2 1 2 7 0 1 8 C0 6 5 0 0 70 5 8 0 0 60
15、4 9 O 0 7 0 3 8 0 1 70 9 2 0 0 71 2 0 3 叫1 0 5 0 1 3 一 I ，1 7 0 1 4 1 4 5 O 1 9 + “。1 2 8 0 1 3 一0 7 0 0 0 9 “1 1 1 0 2 l “ y 21 2 8 0 1 3 “1 0 4 0 1 2 1 3 7 0 2 0 “1 1 6 O 0 6 1 1 2 0 2 2 一I 1 4 O 1 3 “ t 31 2 8 0 1 1 一“+ I 4 3 O 1 5 l - 0 7 0 1 4 1 0 9 O 1 1 洲1 胛O 2 1 -1 1 6 0 2 3 P 0 0 5 ，一P O 0 l 与c 组比较；P 0 0 5 ，“P O O l 与s 组比较；。P 0 0 5 _ P O O l 与T 1 组比较 P O 0 5 ，。P ( 0 0 l 与y 3 组比较。 新生7 天的大鼠海马N R 2 Bm R N A 表达随着时间的变化逐渐下降。与 s 组相比，c 组在H I 后2 hN R 2 Bm R N A 表达显著降低( P 0 0 5 ) ，但在H I 后6 h 、1 2 h 和l d 无显著差异，在H I 后3 d 表达开始增加，但仍无显著差异， 至H I 后7 d ，表达显著增加( P 0 0
