《脑灵汤对alzheimer病模型鼠海马ca3区域α4nachr和α7nachr表达的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脑灵汤对alzheimer病模型鼠海马ca3区域α4nachr和α7nachr表达的影响（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中南大学 硕士学位论文 脑灵汤对Alzheimer病模型鼠海马CA3区域4-NachR和7- NachR表达的影响 姓名：金万存 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：杨剑钢 20100501 硕I j 学位论文 摘要 目的：探讨脑灵汤对阿尔茨海默病( A l z h e i m e r S ，A D ) 模型大鼠学习 记忆、病理形态及其对海马C A 3 区a 4 N a c h R 和a 7 N a c h R 表达的影响， 并揭示A D 发病的部分机理和为寻找中医药治疗A D 提供可能的理 论基础。 方法：选用清洁级S D 大鼠经Y 迷宫测试后，选取3 0 只，随机分 为正常
2、组、假手术组、模型组、西药组( 多耐派齐组) 和中药组( 脑 灵汤组) ，每组6 只，喂养一周后，采用A p l - 4 2 注射大鼠海马法制成 大鼠模型，再喂养3 0 天，治疗后用Y - 迷宫试验和M o m s 水迷宫检测 大鼠学习记忆行为能力，用刚果红染色观察大鼠海马部位p 淀粉样蛋白 沉积的情况，H E 染色检测大鼠海马组织形态学变化。免疫组化法观察 a 4 N a c h R 、a 7 N a c h R 在大鼠海马C A 3 区中的表达。 结果：1 Y - 迷宫实验中，模型组大鼠所需的电击次数最多，与假手 术组和正常组比较p O 0 5 ) 。 8 硕十学侮论文 第一章 表1 -
3、2M o r r i s 水迷宫实验结果( 元由) 金 垦 鲁 喇 剥 注：与正常组和假手术组相比，A p 0 0 1 P B S 清洗5 m i n 一 3 H 2 0 2 去离子 水孵育5 1 0m i n ，消除内源性过氧化物酶活性； 封闭孵育：再转入装满正常山羊血清4 8 孔板室温孵育l O 1 5 分钟，封闭非特 异性抗原- 分别入装满1 ：1 0 0 一抗a 4 - N a e h R ( 以0 1 MP B S 配制) 的9 6 孔板，4 。C 孵育过夜 o 0 1 M P B S 洗3 m i n 3 次_ 再转入装满生物素标记的羊抗兔l g G 的4 8 孔板，室温下孵育1
4、h _ O 0 I M P B S 洗3 m i n x 3 次_ 再转入辣根酶标记链酶卵白生物 素的4 8 孔板，室温下孵育l h 一 O 0 1 M P B S 洗3 m i n x 3 次 D A B 显色3 m i n ，镜下控 制反应程度 冷P B S 终止反应，O 0 1 M P B S 洗3 m i n x 3 次； 复染：多聚赖氨酸处理过的玻片贴片一 风干- 苏木素轻度复染l m i n 。流 水洗去苏木素液5 “ - - 1 0 秒- 1 盐酸乙醇分化1 3 秒，水洗1 2 秒_ 促蓝液返 蓝5 “ - 1 0 秒，水洗1 5 3 0 秒； 封片：5 0 乙醇3 m i n
5、- - - + 7 5 乙醇3 m i n - - - ，9 5 乙醇3 m i n 一无水乙醇3 m i n 依次 脱水各1 次_ 二甲苯透明3 m i n x2 次_ 中性树胶封片，4 “ C 保存。 1 2 5 2 a 7 - N a c h R 免疫组织化学染色 按照S P 免疫组化试剂盒说明书操作： 切片处理：冰冻切片自冰箱取出，在装满O 0 1 M P B S ( p H 7 4 ) 的6 孔板中洗 5 m i n - - 0 3 T r i t o n X 一1 0 0 室温下浸泡3 0 m i n - - P B S 清洗5 m i n - - 3 H 2 0 2 去离子水孵
6、育5 1 0m i n ，消除内源性过氧化物酶活性； 封闭孵育：再转入装满正常山羊血清4 8 孔板室温孵育1 0 1 5 分钟，封闭非特 异性抗原。分别入装满l ：1 0 0 一抗a 7 - N a c h R ( 以O 1 MP B S 配制) 的9 6 孔板，4 孵育过夜一 0 0 1 M P B S 洗3 m i n x 3 次一 再转入装满生物素标记的羊抗兔I g G 的4 8 孔板，室温下孵育1 h - O 0 1 M P B S 沈3 m i n x 3 次一 再转入辣根酶标记链酶卵白生物 素的4 8 孔板，室温下孵育1h - _ O 0 1M P B S 洗3 m i n x 3
7、 次- D A B 显色3 m i n ，镜下控 制反应程度一 冷P B S 终I I = = 反应，0 0 1 M P B S 洗3 m i n x 3 次： 复染：多聚赖氨酸处理过的玻片贴片一J x L 干一苏木素轻度复染1 m i n 一流水沈 1 9 硕f ：学f 谚论文 第一章 去苏木素液5 1 0 秒_ 1 盐酸乙醇分化l - - 3 秒，水沈l “ - - 2 秒一促蓝液返蓝5 1 0 秒，水沈1 5 一- - 3 0 秒； 封片：5 0 乙醇3 m i n - - - ，7 5 乙醇3 m i n - - - ，9 5 乙醇3 m i n _ 无水乙醇3 m i n 依次 脱水
8、各1 次一二甲苯透明3 m i nx 2 次_ 中性树胶封片，4 。C 保存。 以上两组免疫组化阴性对照实验：均用0 0 1 M P B S 代替一抗，以排除二抗的非 特异性染色，与实验片同步进行染色。 1 2 6 结果判断 a 4 - N a c h R 免疫组织化学结果判断 a 4 - N a c h R 免疫组化阳性免疫反应产物应呈棕黄色颗粒，重点观察海马C A 3 区阳性 细胞的着色形态、数量和组织分布特点。a 4 - N a c h R 于静息状态下，位于神经元细胞 的突触膜上小胶质细胞细胞上，胞浆，包膜均有表达，光镜下细胞浆呈现为黄褐色， 核为蓝紫色，视为阳性细胞；a 4 - N
9、a c h R 激活后，转位入核，细胞核呈现为黄褐色苏木 素不能复染，亦视作阳性细胞。每只大鼠取有海马C A 3 区的5 张不同断面切片( 这些 切片在5 组保持断面一致) 进行a 4 - N a c h R 免疫组化染色。运用I m a g e P r o 全自动图像分析 仪对鼠脑组织切片海马区进行图像分析。每组取6 只大鼠脑组织切片，每只在位置相 同部位各选5 张脑片，每张切片在4 0 0 倍光镜下随机选位置大致相同的5 个海马视野， 共2 5 个视野只，每个视野约5 0 个细胞。经灰度调节后，按设定程序自动测出阳性神 经元终术灰度值，取平均值做统计。 ( 至) a 7 - N a c h
10、 R 免疫组织化学结果判断 a 7 - N a c h R 免疫组化阳性免疫反应产物也应呈棕黄色颗粒，重点观察海马C A 3 区阳 性细胞的着色形态、数量和组织分布特点。每只大鼠取有海马C A 3 区的5 张不同断面 切片( 这些切片在5 组保持断面一致) 进行a 7 - N a c h R 免疫组化染色。着重观察阳性细胞 的着色形态和组织分布特点。运用I m a g e P r o 全自动图像分析仪对鼠脑组织切片海马 C A 3 区进行图像分析。经灰度调节后按设定程序自动测出每张切片C A 3 区5 个随机高 倍视野( x 4 0 0 ) 的阳性神经元终木狄度值，取平均值做统计。 a 4 N
11、 a c h R 与a 7 - N a c h R 免疫组织化学结果比较 通过对此各组a 4 - N a c h R 与a 7 - N a c h R 免疫组织化学阳性细胞计数比较，分析脑灵汤 对脑内炎症区海马C A 3 区N a c h R s 和神经保护功能的影响。 2 0 硕 ：。何论文第二章 1 2 7 统计学处理 同前 2 结果 2 1A 4 - N A C H R 免疫组织化学结果 2 1 1a 4 - - N a c h R 免疫组化定位定性结果 a 4 N a c h R 免疫反应阳性神经元主要表现为细胞浆呈现为黄褐色，苏木素复染。各 组大鼠海马C A 3 区a 4 - N a
12、 c h R 表达的比较见图3 5 图3 9 ( 采用P B S 作为一抗阴性对 照，染色结果见图3 1 0 ) 。由图3 5 和3 6 可见，J 下常组和假手术组在海马 C A 3 c t 4 - N a c h R 阳性细胞表达最多，大多为胞核着色，胞浆着色成棕褐色，形态变异较 大，主要分布于锥体细胞层及颗粒细胞层，而多形细胞层和分子层内极为少见；图3 7 可见模型组大鼠海马C A 3 区区神经元仅有少量a 4 - N a c h R 阳性细胞，均为胞浆着色， 色浅，形态单一，亦主要见于颗粒细胞层：大部分为多成环状、梭形和锥体形，以 神经元为主俾 等。部分胆碱酯酶抑制荆作用的途径之一就是激
13、活突触后的n A C h R 受体1 6 l 。随着研究的深入，n A C h R 在A D 的关系越来越受到人们的重视。 硕十z 侍论文 综述 2 1 烟碱型乙酰胆碱受体与认知的关系 已有的研究表明，脑中n A C h R 参与许多复杂的功能，如：注意、学习、觉醒和 认知功能等。通过多种方法，例如：w e s t e r nb l o t t i n g t7 1 、免疫组化分析f 8 】，配体结合试 验( 【3 H 】e p i b a t i d i n e 、【1 2 5I c t 2 b u n g a r o t o x i n ) 【9 1 ，以及F 电子发射断层扫描 ( P E
14、 T ) I m l ，都发现在A D 的病理发生过程中伴随着n A C h R 的减少，并且含o 4 1 3 2 n A C h R 相对于包含0 , 7n A C h R 减少得更多。大量的流行病学发现，吸烟者A D 的发 病率明显降低，而给A D 患者予以吸烟治疗后，记忆力明显改善，进一步的研究 发现，吸烟者大脑皮层、海马等部位的N 受体数目明显高于非吸烟者。随后的动 物研究发现利用缺乏Q 7 亚单位n A C h R 的小鼠与对照组比较发现，前者在水迷宫实 验中存在学习、记忆等认知能力的低下1 1 4 】。P o e i v a v s e k 等1 1 5 】向雌性大鼠的海马腹 侧缓
15、慢灌注仅7 受体亚型的拮抗剂一甲基乌头碱和a 4 p 2 受体亚型的拮抗剂一二氢刺 桐碱，经半径臂迷宫测试发现，灌注二氢刺桐碱的大鼠空间记忆能力降低。对小鼠 进行慢性尼古丁治疗，发现在其大脑中乙酰胆碱的结合位点增J J N ；而对其大脑皮层 进行免疫沉淀研究，发现烟碱受体c 【2 和陋亚单位的数目发生上调】。随后在特异 表达伍7 或e 2 p 4n A C h _ R 的H E K 细胞体外实验中，证明n A C h R 的一些部分或完全 激动剂，例如D M P P 、野靛碱、地棘蛙素等都可以产生这种上调效果，这种上调不 一定与受体的数目相关，而是功能的上调【1 2 , 1 3 】。 2 2
16、烟碱型乙酰胆碱受体与A p 的关系 A p 是S P s 的主要成分，是一种神经毒性物质，可引起神经元的损伤和死亡，是神 经细胞外淀粉样斑块的主要成分，可通过多种机制导致A D 的发病，是A I D 的病理 标志之。研究显示n a c h R 是A p 的高亲和力位点，A D 能阻断n A C h R 激动剂与海马 神经元一k n A C h R 的结合。这种内源性A D 对于基底前脑和海马中n A C h R 的阻断作 用提示，A p 靶向作用于神经元n A C h R 导致T A p 对于认知功能的损伤。研究表明， n A C h R 不仅参与脑内神经系统的功能的发挥，而且还受A B 的调节I l6 。A p 可通过 氧化过程影响n A c h R 胆碱受体功能。特别是0 【7 受体，在调节A D 的神经毒性方面可 能发挥重要的作用，且与A p l 4 0 相比，0 , 7 一
