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1、毛细管电泳激光诱导荧光检测分枝杆菌D N A 多态性牛 黎源倩王国庆米建萍周颖 四川大学华西公共卫生学院成都6 1 0 0 4 1 以结核病为代表的分枝杆菌病已经对全世界人类的健康形成了极大的威胁。传统分枝杆 菌病的诊断主要依靠病原学方法，主要依据细菌的分离、培养及生化鉴定。由于分枝杆菌生 长缓慢，该法耗时长，生化检验项目多，不利于临床早期诊断和治疗。P C R 限制性内切酶谱 分析( P R A ) 在分枝杆菌中的分类鉴定中逐步得到了应用，但通常采用经典琼脂糖凝胶电泳法， 分辨率和灵敏度都不够高。高效毛细管电泳技术是近年来发展迅速的分离分析方法，具有分 辩率高，分离速度快，样品用量少( n
2、L ) ，分析成本低的优点，特别是采用激光诱导荧光检测 器可使毛细管电泳法的灵敏度大为增加【l 】。根据酶切后片段多态性差异，可分析基因组同源性， 并进行个体分类鉴定。 分枝杆菌中广泛存在h s p 6 5 基因，编码一种分子量为6 5 0 0 0 的细胞壁抗原蛋白。该基因全 长约1 3 0 0b p 。T e l e n t i 等设计引物扩增了该基因第3 9 8 8 3 6 碱基对之间的片段，并采用内切酶 对扩增片段进行酶解后，用琼脂糖电泳分析其片段的长度多态性幢。本研究以分枝杆菌的h s p 6 5 为目的基因，采用一对引物扩增出该基因中4 3 9 b p 的片段，该扩增片段经限制性内切
3、酶B s t E I I 和H a e l I I 酶切后，分别用琼脂糖电泳和高效毛细管电泳分离酶切片段，对分枝杆菌进行分 类鉴定，将对结核病的发病机理和探讨疾病临床早期诊断和预防具有重要意义。 1 实验都分 1 1 仪器与试剂 毛细管电泳激光诱导荧光检测装簧( 自行组装) ，氦氖激光器( 5 4 3 5 n m ) 。毛细管( 河 北永年光导纤维厂) 。毛细管柱内表面的聚丙烯酰胺化学键合涂层由本实验室完成。U N O 型 P C R 仪，P A C 3 0 0 0 型电泳仪，U V I 紫外成像分析仪。柱式细菌D N A 抽提试剂盒。 草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌( 9 3 2 0 3 ) 、蟾
4、分枝杆菌、龟分枝杆菌脓肿距种临床分离株、 偶发分枝杆菌等1 3 种分枝杆菌购自中国药品生物制品检定所。限制性内切酶B s t E I I 和H 勰I ， T a qD N A 聚合酶，d N T P s ，P U C l 9 D N A M S P I ( H P a l l ) M a r k e r2 3 。引物P 1 ：5 - A C C A A C G A T G - G T G T G T C C A T 3 、2 ：5 C T T G T C A A C C G C A T A C C C T 3 ，上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。 1 2 实验方法 1 2 1 分枝杆菌基
5、因组D N A 的提取：罗氏培养基上培养物1 2 接种环，加灭菌重蒸水1 5 m l ， 研磨成混悬液，然后按D N A 抽提试剂盒说明二体进行。 1 2 2P C R 扩增：灭菌高纯水3 2 5u I ，1 0 缓冲液5u l ，4 d N T P s4 l a l ，p l 、p 2 各lu I ，模板 D N A2 l a l ，T a q 酶( 3 U u 1 ) 1 5u l ；总体积5 0p l 。P C R 反应条件为预变性9 4 5 m i n ，变性9 4 1 r a i n ，退火5 8 1 m i n ，延伸7 2 l m i n ，循环数3 5 ，最后再7 2 5 m
6、i n 。 1 2 3 限制性内切酶切：将P C R 扩增产物分别用限制性内切酶B s t E I I 和H a e I 进行酶切。反应 体系5 0u l ，分别为P C R 产物2 0u l ，灭菌高纯水2 3u I ，1 0 缓冲液5u l ，限制性内切酶( 1 0 U u 1 ) 2u l 。反应条件为3 7 Cl h 。 1 2 4 高效毛细管电泳一激光诱导荧光检测：调整好毛细管电泳激光诱导荧光检测装置的光 路系统。在进行电泳分析前，毛细管柱先填充0 1 甲基纤维素，雨充以0 5 甲基纤维素+ 溴 乙啶。分离所用的缓冲溶液为T B E 溶液( p H 8 5 ) 。分别取P C R 扩
7、增产物、B s t EI I 酶切产物和 H a e I 酶切产物，在1 0k V x l 5 s 电进样，恒压1l k V 电泳，用激光诱导荧光检测装置在波长为 5 9 0 n m 处，检测溴乙啶与D N A 片段嵌合所产生的荧光。采用计算机采集数据，用C + + 语言编 制的w i n d o w s 软件进行分析处理。 1 3 5 琼脂糖凝胶电泳：分别取P C R 扩增产物、B s t E I I 酶切产物和H a e I I I 酶切产物l O l J l ，J J l 6 上样缓冲液2u l ，混匀后上样于2 的琼脂糖凝胶( 含溴乙啶) 上，8 1 0 V c m 电泳7 0 m i
8、 n 。 本研究为国家自然科学基金资助课题：批准号3 0 0 7 0 6 7 8 和3 0 0 7 0 6 8 5 。 取一F u v 凝胶于凝胶成像仪上观察电泳图谱。 2 结果与讨论 2 1 毛细管电泳分离条件的选择 分别采用不同内径和长度的石英毛细管柱( 内径为7 5 p m ，长度分别为5 0 c m 幂1 1 6 5 c m ；内径 为1 0 0 p m ，一长5 0 c m ) 进行试验，实验结果表明，内径为1 0 0 1 a m ，长5 0 c m 的毛细管用于分离P U C l 9 D N A M S P I ( H P a l I ) M a r k e r2 3 的1 1 个
9、D N A 片段和分枝杆菌P C R 限制性内切酶产物效果较好。 分别采用1 0 m m o l L 的硼酸盐溶液和T B E 溶液作为电泳缓冲溶液，实验表明，用T B E 溶液 作为电泳缓冲溶液分离D N A 片段，分辨率高，电泳峰形好。改变T B E 缓冲溶液的浓度为 5 m m o l L 4 0 m m o l L 进行试验，当电泳缓冲溶液的浓度偏低，电渗流加快，有效淌度差减小， C E 分辨率降低；当缓冲溶液的浓度偏高，焦耳热效应使轴向扩散增加，分离效率也受到影响。 本实验选用1 0 m m o l LT B E 溶液作为电泳缓冲溶液。 电泳电压对分枝杆菌D N A 的P C R 扩
10、增产物和酶切产物的迁移时间有显著的影响，改变电 泳电压为8 k V 1 2 k V ，考察本实验中所用P U C l 9D N A M S P I ( H P a l l ) M a r k e r2 3 的1 1 个D N A 片段的分离情况。随着电泳电压的增加，M a r k e r 的D N A 片段的迁移时间不断减少，电泳分析 的时间减少；但是当电泳电压太高时，3 3 l b p 、4 0 4 b p 、4 8 9 b p 并1 1 5 0 1 b p 片段的电泳峰部分重叠， 不能达到基线分离，所以本实验选用ll k V 为电泳电压。 在本实验选用的最佳电泳条件下，P U C l 9D
11、 N A M S P I ( H P a l I ) M a r k e r2 3 的11 个D N A 的片 段，除ll O b p 并H l ll b p ，4 8 9 b p 雨1 5 0 1 b p 不能分离外，其余片段均可完全分离，其电泳图谱见图1 。 圈1P O C l 9 喇 鸺P I ( 咿I I )圈2 龟分枝扦1 1 1D 卧的图3 龟分校杆蕾B u t E 1 1圈4 龟分枝扦e l l l m a r k e r2 3 电溶圈P c 扩增产物电泳圈切产铀电泳豳奠切产稳电泳圈 I - 1 0 ：分别为3 4 ，3 4 , 6 7 ，1 1 0 1 1 1 , 1 4 7
12、，1 7 6 b p2 4 3 9 b p1 2 4 0 b p ，2 2 6 0 b p1 5 5 b p ，2 1 0 5 b p ，3 1 5 0 b p 1 9 0 。2 4 2 ，3 3 1 ，4 0 4 ，4 8 9 5 0 1 b p 2 2 操作参数和进样量的选择 综合考虑检测灵敏度和基线噪声，光电倍增管负高压设定为一1 0 0 0 V 。由于分枝杆菌D N A 经P C R 扩增后的酶切产物浓度较低，进样电压和时间太小，往往不能检出小片段的D N A ，因 此本实验选用进样电压为1 0 k V ，进样时间为1 5 s 。 2 3 毛细管电泳一激光诱导荧光检测和琼脂糖凝胶电泳比
13、较 对1 3 种分枝杆菌D N A 的P C R 扩增产物、B s t EI I 酶切产物和H a e I I I 酶切产物分别进行激 光诱导荧光检测毛细管电泳和琼脂糖凝胶电泳，其中龟分枝杆菌脓肿皿种临床分离株D N A 的P C R 扩增产物、B s t E I I 酶切产物和H a e I I I 酶切产物的毛细管电泳图见图2 4 。通过比较普通 琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳对h s p 6 5 基因P C R 产物酶切片段的分离效果，结果表明，本实 验所用的毛细管电泳激光诱导荧光检测装置能在1 5 m i n 完成P C R 产物酶切片段的分离，可 以得到不同分枝杆菌各自特异的D N A 酶切谱图。由图3 和4 可见，龟分枝杆菌B s t E I I 酶切产 物电泳后显示2 4 0 b p 和2 6 0 b p 的两个电泳峰。H a e l I I 酶酶切产物的电泳峰分别5 5 b p ，1 0 5 b p 和 1 5 0 b p ，与琼脂糖凝胶电泳的结果有较好的可比性。 本文采用毛细管电泳激光诱导荧光检测进行分枝杆菌P C R 限制性内切酶谱分析，能有效 地检测基因多态性，方法简便、快速，将酶切产物浓缩后再电泳，能进一步提高检测灵敏度。 但采用分枝杆菌基因的限制性片段多态性( R F L P ) 鉴别分枝杆菌的研究工作还有待进一步的 深入。 参考文献( 略) 1 5 1
