干旱胁迫对小麦的生理生化化指标的影响

2、于自然环境是个变数，其水热条件随时都变化，对植物多少会产生一些影响。凡是对植物产生伤害的环境都被称为逆境，也称胁迫。干旱也属于逆境，水分在植物的生命活动中占主导地位，大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。植物的生长主要是叶的生长，但Hsico等(1987年)指出,叶的扩展生长对缺水最为敏感，轻微的胁迫就会使其受到明显限制。扩展生长不论是细胞分裂分化或体积扩大,都同时依赖于水的吸收、溶质的积累和胞壁的松驰。任何能直接或间接影响三者之一的因素均能影响生长。当植物受到逆境胁迫时，会采取一定的措施来抵抗不良环境，比如生理生化指标Pro、MDA、H2O2、PPO、GSH、WSS、P

3、OD等发生变化。小麦是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物，也是我国北方主要的粮食作物之一。世界上约有70的小麦播种面积分布在干旱、半干旱农业区。其在生长过程中，经常会受到干旱的影响，在世界范围内，由于水分所造成的减产，可能要超过其他因素所导致的产量损失总和。，干旱胁迫下小麦的生理生化特性差异被认为是小麦抗旱性差异的内在原因。本次实验是研究吸胀12小时萌发一周后，干旱处理5天的小麦其生理生化指标含量的变化，这可以为抗旱研究作出一点贡献。1 材料和方法1.1 供应材料。小麦种子；主要试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6

4、%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制，PBS, （pH=5.8,内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。1.2材料处理。经发芽率测定，小麦的发芽率是100%。小麦用0.1

5、% HgCl2消毒10 min后用蒸馏水漂洗干净用蒸馏水于26下吸涨12 h 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中于26下暗萌发60 h 计算发芽率选取长势一致的玉米幼苗做干旱、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。1.3 实验方法。 1.31 Pro的提取步骤和结果。分别取0.1 g实验组（为干旱处理5天）和对照组（不做干旱处理）的胚芽鞘置于研钵中，加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨，再用2 mL 3% SSA洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：取上清液各2 mL ，分别

6、加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂再煮沸15 min，冷却后，5000 rpm离心10 min ，分别测定A520 。 Pro content = (mmol.g-1FW) 表一 Pro正常组和实验组A520的 Pro content由图表可知，正常组的Pro汉两为9.95(mmol.g-1FW)，而干旱胁迫组的Pro含量为97.69(mmol.g-1FW)，后者是前者的9.8倍。由此可见正常情况下脯氨酸的含量较小，一旦受到干旱胁迫，其含量就会大幅度增加。1.32 丙二醛（MDA）提取。分别取0.1 g实验组和对照组（与1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 50mM PBS (pH

7、=7.8)和少许石英砂充分研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置与离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：分别取上清液各2 mL ，加入0.6%TBA（用0.6% TCA配制） 2 mL，煮沸12 min，冷却后，5000 rpm离心10 min ，分别测定OD450和OD532。正常（对照组）干旱胁迫（实验组）Pro content9.95(mmol.g-1FW)97.69(mmol.g-1FW)表二正常组和实验组A450、A532下的WSS、MDA浓度正常（对照组）干旱胁迫（实验组）可溶性糖(WSS)3.36 mmol/L16.80 mmol/L丙

8、二醛(MDA)0.23823umol/L1.04755umol/L由图表可知，可溶性糖和丙二醛的浓度都是实验组大于对照组，实验组，即受干旱胁迫组的可溶性糖的浓度是正常组的5倍，丙二醛浓度是正常组的4.4倍。可知，干旱胁迫会使小麦麦芽鞘的可溶性糖和丙二醛的含量增加。1.33 H2O2 提取。分别取0.1g实验组和对照组，加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂充分研磨，用2 mL PBS洗研钵，5000 rpm离心10 min ，上清液定容至5 mL。测定：分别取上清液各3 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 1 mL，

9、摇匀。5000 rpm离心10 min ，OD410。H2O2 content = (mmol.g-1FW)表三正常组和实验组OD410下的H2O2浓度正常（对照组）干旱胁迫（实验组）H2O2 content38.81(mmol.g-1FW)139.29(mmol.g-1FW)由以上图表数据可得，干旱胁迫可使小麦胚芽鞘的H2O2含量升高，干旱组是正常组的3.5倍。1.34 抗氧化酶的提取。分别取0.1 g实验组和对照组（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂，充分研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置于离心机中，在50

10、00 rpm下离心10 min ，取上清液，定容至5 mL。测定：POD测定；取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液（提取液）100 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470 。PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液（提取液）0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410 。POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)PPO activities = (U.g-1

11、FW)正常（对照组）干旱胁迫（实验组）POD(mmol.g-1FWmin-1)24.2714.21PPO (U.g-1FW)1501950上表中，过氧化物酶(POD)的含量正常组的是24.27(mmol.g-1FWmin-1) ，而实验组的是14.21(mmol.g-1FWmin-1) ，后者是前者的0.59倍，是所有测的数据中唯一正常组大于实验组的。多酚氧化酶(PPO) 的含量正常组的是150 (U.g-1FW)，而实验组的是1950(U.g-1FW)，后者是前者的13倍，可知干旱胁迫会使小麦胚芽鞘的多酚氧化酶含量剧增。1.35 GSH的提取。分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘（同1.3

12、2做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨，用2 mL 5% TCA洗研钵置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min ，取上清液定容至5 mL。测定：上清液各1 mL ，分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7) 和0.5 mL 4 mM DTNB (用0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替)，25 5 min，分别测定A412 。GSH content = (mmol.g-1FW)正常（对照组）干旱胁迫（实验组）GSH content1.22(mmol.g-1FW)3.86(mmol.g-1FW)由图表可知，实验组GSH

13、3.86(mmol.g-1FW)是正常组1.22(mmol.g-1FW)的3.16倍，干旱胁迫会使胚芽鞘积累谷胱甘肽(GSH)。2 讨论本次试验我们的结果是，干旱胁迫小麦胚芽鞘中的脯氨酸(Pro)含量比正常小麦的多几倍，即干旱下小麦积累了脯氨酸(Pro)。已有很多试验证明了，干旱胁迫会使脯氨酸含量增加。脯氨酸（Pro）是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供

14、足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时体内的脯氨酸含量明显增加。已有人证明了Pro的分解代谢开始于它的氧化分解，执行此功能的酶称为Pro脱氢酶(PDH)，它以FAD为辅因子将Pro降解为P5C，后者在P5C还原酶(P5CR)的作用下又重新合成谷氨酸，完成Pro代谢的循环过程。所以，在Pro的降解过程中，PDH是Pro降解的关键酶。在逆境胁迫过程中，PDH的活性往往受到不同程度的限制，从而削弱了Pro的降解过程，因此越来越多的脯氨酸被积累。两种抗氧化酶，多酚氧化酶和过氧化物酶在干旱胁迫中表现出不同的变化情况，多酚氧化酶的含量较正常组呈上升趋

15、势，而过氧化物酶则呈下降趋势。过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶,它的作用主要是将过氧化氢水解。过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质,氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中,从而对细胞起保护作用。干旱锻炼提高小麦幼苗抗旱性的抗氧化机理研究中已经指出，连续干旱锻炼的小麦幼苗体内的POD活性下降,羟自由基清除能力及总抗氧化力降低,总体上表现为抗氧化系统受到抑制。高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果，PPO催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果产生黑色素沉淀。PPO在植物中以潜伏PPO形式存在，与叶绿体膜紧密结合潜伏形式的通常在成熟、衰老或胁迫条件下，由于膜受伤害而活化，并导致 PPO活性增加。所以综上所述逆境胁迫下多酚氧化酶的含量增加，而过氧化物酶则减少。干旱，小麦胚芽鞘中的可溶性糖(WSS)和脯氨酸(MDA)的含量都增加。同样，在几种环境胁迫对小麦生理生化影响一文中已经研究发现，干旱胁迫会使小麦中WSS和MDA含量增加。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰

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