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1、链霉素发酵工艺验证方案1. 目的：确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备 的发酵液能否达到中间体规格要求。2. 范围：此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。2.1 验证地点：403车间发酵工段：2.2 验证对象：2.2.1 原斜面2.2.2 代1、代2斜面2.2.3 母瓶2.2.4 子瓶2.2.5 小小罐2.2.6 小罐2.2.7 中罐2.2.8 大罐2.3 验证步骤：确定验证方案，确定验证计划，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。3. 验证措施概要：3.1 生产记录：原斜面：冷藏期10天外
2、观无菌外观集落:白色丰满、正常代1或代2斜面：冷藏期14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时1700u/ml效价96小时3500u/ml效价120小时6700u/ml冷藏期5天菌龄5064小时菌丝IIIII子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时7000u/ml效价144小时7500u/ml冷藏期7天菌龄3044小时菌丝IIIII小小罐：菌丝IIIII镜检无菌放罐效价800u/ml，残C3.5g/100ml，残N140mg/100ml，PH7.5小罐：菌丝IIIII镜检无菌放罐效价1200u/ml，
3、残C3.5g/100ml，残N140mg/100ml，PH7.5中罐：菌丝IIIII镜检无菌放罐效价1800u/ml，残C3.5g/100ml，残N140mg/100ml，PH7.5大罐：放罐残糖2.0克/100毫升放罐残氮120毫克/100毫升放罐透光度40%放罐效价14000u/ml3.2 原材料：生产过程中所用的各种原材料及其规格（见原材料一览表）3.3 设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。3.4 以上所及设备的每一部分，必须在本次验证前确保经过适当鉴定（IQ/OQ），并且任何相关的测试装置经过校正。3.5 人员培训，作为验证研究的一部分，涉及生产链霉素发酵的每位职工均经GMP及有关岗
4、位SOP培训。4. 生产程序和流程表：4.1 生产过程的描述：4.1.1 我厂用于生物合成链霉素的生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种的生命活力和稳定性，将孢子保存于干燥的沙土内冷藏在24冰库内，或者将孢子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于196液氮中。每年对生产菌株进行两次自然分离，控制菌落变异率5%，并进行菌丝八代遗传稳定性考查，考查其母、子代谢及效价单位的稳定性。挖取清洁海滩细沙（不能污染各种有机物），用自来水漂洗清洁，洗至漂出来的水澄清不浑浊为止，烘干、100目筛子过筛，用磁铁充分吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土（不能污染各种有机物），用自来水充分漂洗消毒，洗至漂出来的水澄清为止，烘
5、干，120目筛子过筛,用磁铁充分吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装于玻璃试管（12100mm），每支装1g，用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MPa，温度122，时间1小时，消毒后置电烘箱烘干，110120、45小时，外表明批号、日期备用，使用前为确保无菌起见，应按以上要求再消毒烘干一次。取符合质量要求的孢子斜面一支，在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水1ml左右，用1#棒将表面孢子轻轻刮下（防止用力过重划破琼脂）摇匀，用1ml割头无菌吸管吸出，准确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1ml孢子液（加入时应注意将吸
6、管伸至接近沙土处，但又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁）。塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空干燥器内（干燥器内放置氯化钙干燥剂）保持真空度0.10MPa，抽4支时维持抽干4小时，抽5支或以上时，抽干时间酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封，放24冰库中保存备用。使用时采用干接法接种。孢子沙土管有效使用期为2年。市售新鲜牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115117，0.07MPa，1520分钟消毒。将空白安培管洗净烘干，塞好棉花，置于消毒锅内121，60分钟，间隙灭菌三次，待用。取符合质量要求的孢子斜面一支，加
7、入无菌脱脂牛奶510ml，用2#棒轻轻将孢子刮下，用无菌吸管吸孢子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，振摇10分钟,然后用1ml 无菌吸管将珠子瓶内的孢子牛奶悬浊液加入无菌安培管中，0.3ml/支，做好标记存置于液氮中保存，存放有效期5年。4.1.2 种子组洁净工作台洁净等级100级，每三个月对尘埃粒子（0.5u的尘埃3.5粒/1L空气）、风速（0.35m/s）、无菌（定点开启双碟30分钟1个/碟）进行测定。平时每次操作定点放置定点开启双碟30分钟，控制杂菌菌落1个/碟。每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消毒剂（1/600洁尔灭、75%酒精）。4.1.3 孢子斜面：取生产用之孢子沙土管或孢子冷冻管在无
8、菌室内，用操作棒勺取适量孢子接种于斜面培养基上，尽量将孢子涂开使长单个集落，然后于271恒温室内培养67天，该生长成之孢子斜面称为原斜面，仅作孢子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻孢子接出原斜面。根据质量情况可酌量考虑制作母瓶，有效使用期在24冷藏中不超过10天。斜面外观除了个别不正常集落以外，应大部份为白色，丰满梅花型，馒头型、圆型之集落，将原斜面孢子，挑选23只正常集落点种第一代，用第一代传代斜面同样点种第二代传代斜面，第一第二代孢子斜面，培养条件均为27l恒温室内培养67天，第一、第二代斜面有效使用期为14天，均可制作母瓶，孢子斜面传到第二代为止，不再传第三代，挖块制作过母瓶之剩余孢子斜面
9、，应保留在冷藏库中一个月，以备检用。斜面培养基配制法：名称配比 %葡萄糖（注射用）0.81.2蛋白胨0.30.6氯化钠0.40.6豌豆浸出液1216琼脂（海燕牌）2.02.8pH7.07.4消后规格:C (g/100ml)0.9-1.2N (mg/100ml)32-38P (ug/ml)60-90pH6.8-7.5豌豆浸出液制备：豌 豆： 30克氯 仿： 0.5%（二次）自来水： 加至1000ml1M H2SO4：调pH用将30克豌豆洗净沥干，加入1000ml自来水，用1M H2SO4，调 pH至4.24.5，加 0.5氯仿、盖上磨 砂瓶塞，振荡摇匀后，放出气体，再盖紧放置于 37恒温室一昼夜
10、取出，再用 1MH2SO4调节PH值维持在 4.24.5，加 0.5%氯仿摇匀、盖紧放 371 恒温室 6天，粗滤除去豌豆，滤液分盛于开口的搪瓷杯中，置沸水浴中，煮沸20分钟（去除氯仿）冷却，用滤纸过滤，去除沉淀的蛋白质、分装于 750ml摇瓶中，每瓶装量约200ml左右，以 0.09Mpa、118120的条件消毒 20分钟，冷却后放入冰箱中备用。同时抽样送化验，检验质量，在使用该批豌豆浸出液时，必须再送一次样品，测定氨氮含量与第一次相接近时可按后一次样含量计算使用，如第二次含量与第一次不符，须再抽样复试，以最后一次化验数据为准进行计算使用。豌豆浸出液质量：项目规格外观澄清液氨氮（NH2-N）
11、170200mg/100ml磷(PO4)600ug/100ml左右无菌状况无杂菌4.1.4 母瓶：用符合质量标准的同支孢子斜面（冷藏期不超过14天）在无菌室内用挖块法分别将孢子接种到已准备好之二只摇瓶中，编号为母I母 II，接种后送至温度 27l恒温摇瓶间内，在23020r mm摇瓶机上，培养5064小时，菌丝阶段 II一III初之母I用牛皮纸包扎存放于24冷库中，母II继续培养作质量检查，做无菌试验二支，分别进行27及37培养。68小时取样分别测定单位粘度，氨氮消耗、PH、uml，以后每24小时取一次样测定上述项目，共计三次（68小时，96小时，120小时三次）如母瓶质量符合要求，则母瓶可以
12、进罐使用，母瓶有效冷藏期为5天。制得的母瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒、米黄色、无异味不化稀无菌正常。效价：120小时6700uml。接子瓶的母瓶制备法，用无菌操作挖一块斜面，接入一只母瓶，在摇瓶机上培养5064小时，取下，挑选外观正常菌丝粘稠，色泽米黄，无颗粒状菌丝的母瓶，作为接子瓶用，接种子瓶的母瓶不冷藏。遇特殊情况，一般冷藏不超过5天。母瓶原材料及配比如下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黄豆饼粉3.04.5碳酸钙0.50.8硫酸铵0.50.8氯化钠0.250.5磷酸二氢钾0.040.07消后质量规格：C (g/ml)3.84.8N (mg/100ml)130155P (ug/100ml)
13、1301554.1.4 子瓶：取符合种子质量标准之母瓶，在无菌操作条件下，用吸管接入已准备好的子瓶培养基中，每瓶接种量约3ml，瓶数按需而定（母瓶接子瓶前做无菌试验斜面二支，分别培养于27，37恒温室，母瓶接子瓶后，吸管做无菌试验斜面一支，在37恒温室培养），接种后子瓶送27l恒温室培养3044小时，菌丝阶段在IIIII初，长好后，留五瓶继续培养，作质量分析，其中三瓶在120及144小时分别取样测定效价，一瓶测粘度及氨氮，一瓶接无菌斜面二支作无菌试验（分别培养于27，37恒温室）及观察菌丝形态，（新菌株要加测C及PH）其他瓶冷藏于24冰库中备用有效冷藏期为7天，如在保存期间发现有化稀现象或有染
14、菌嫌疑，即停止使用，改用其他批号种子，放摇瓶种子应同时准备有23批瓶存备用。制得的子瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒，米黄色，无异味。不化稀（比母瓶厚）。效价：120小时7000u ml，144小时7500u ml。子瓶原材料及配比如下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黄豆饼粉2.33.5碳酸钙0.20.7硫酸铵0.50.7氯化钠00.2磷酸二氢钾0.0450.07豆油1L玉米浆00.2消后质量规格：C (g/ml)6.04.8N (mg/100ml)160180P (ug/100ml)1551804.1.5 小小罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫的更换检查严密度，检查部分包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌罐则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有无培养基倒流。培养基实行实消：空消时预热至压力达到0.160.19MPa。排出罐内冷凝水后计空消时间为1545分钟，温度为125130，空消时间到后压力跌0MPa进行投料实消。先加水至搅拌处，然后投入已配好的培养基，搅拌成匀浆状加热，打开各支路蒸汽，关闭罐盖待压力上升至0.070.12MPa时计时20分钟左右，消毒温度为115124，结束后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH。小小罐采用摇瓶28瓶火焰接种，加空气流量至0.1
