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1、中南大学 硕士学位论文 脑灵汤对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA3区域IGF-1和IGF-1R表 达的影响 姓名：宋文名 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：何明大 20100501 硕十学位论文 中文摘要 摘要 目的：阿尔茨海默病( A l z h e i m e r Sd i s e a s e ，A D ) 是中枢神经系统的一种渐进 性、进行性、退行性病变，主要表现为认知功能障碍、同常生活能力下降和精神 行为症状其主要病理特征主要是老年斑( s e n i l 印l a q u e ，S P ) 、神经原纤维缠结 ( n e u r o f i b r i l l a r y
2、 ta n g l e s ，N F T ) 及选择性神经元及突触丢失。目前A D 患病率随年龄 增长而增加：即年龄每增5 岁，患病率几乎增加1 倍。现代医学对本病的防治研究 至今尚未取得突破性进展。目前国内外报道2 型糖尿病患者认知功能异常或A D 的 发病率较正常人群高，但涉及的具体原因不明。而胰岛素样生长因子I ( i n s u l i n 1 i k eg r o w t hf a c t o r - I ，I G F I ) 在A D 的发病机制研究中日益受到重视。 中医药的、多途径、多靶点优势对A D 的防治提供了广阔的前景。本文探讨 脑灵汤对阿尔茨海默病( A D ) 模型大鼠
3、行为学、海马组织形态学及海马C A 3 区 胰岛素信号转导通路相关蛋白I G F 1 及受体表达的影响，揭发A D 的部分发病机 理和脑灵汤的作用机制，为指导临床应用和开发新药提供理论和实验依据。 方法：选用纯系S D 大鼠( 雄性) 3 0 只随机分为5 组，每组6 只，分别为正 常组、假手术组、模型组、中药( 脑灵汤) 组，西药( 盐酸多奈哌齐) 组。喂养一 周后，采用聚集态A 1 3 1 - 4 2 、在大鼠双侧海马注射建立A D 模型，造模后喂养2 1 天， 采用Y 一迷宫和M o r r i s 水迷宫检测其行为能力。取大鼠脑组织作冰冻切片，行 刚果红染色检测海马内是否有A 1 3
4、的沉积；H E 染色观察大鼠海马组织形态学改 变；用免疫组化法观察胰岛素信号转导通路相关蛋白I G F 1 及其受体( I G F 1 R ) 在大鼠海马C A 3 区中的表达。 结果：1 Y - 一迷宫实验：模型组大鼠所需的电击次数最多、西药组( P 0 0 5 ) 。 舭I上I 一憨一R誉攀巳l四稚 硕士学位论文第一部份 表卜2 M o r r is 水迷宫实验结果( 夏蜘) 注：与正常组相比，Ap 胰岛素。在对I G F 1I G F I I 两者相比，I G F IR 对 的I G F 1 亲和力为( K d l n m o l L ) 最高、而对I G F I I 的亲和力只有1 4
5、 【1 6 】。 1 5I G F 结合蛋白( I G F B P s ) 胰岛素样生长因子结合蛋I 兰I ( I G F B P s ) 有调节I G F 1 活性作用。目前已发现的 I G F B P 家族有I G F B P l 1 0 ，但现确定出6 种I G F B P s 在调节胰岛素样生长因子流 通及生物活性方面有着密切的联系。I G F B P I - - v 6 在肝脏和全身各组织均能合成， 其中血液循环中的I G F B P s 是主要由肝脏合成的，与I G F 1 和I G F 2 结合，不能结合 胰岛素，在血液中与大部分I G F 1 结合以复合物的形式存在，运输I G
6、 F 1 到靶器官 发挥作用具有调节I G F s 生物利用度活性的作用1 “ 1 。 在胰岛素样生长因子结合蛋白( I G F B P s ) 中、I G F B P 3 是人类血液中数量最多， 作用最强，也是唯一受G Hi 卜I 调节的结合糖蛋自，其分子量为5 3 K _ D I G F B P 3 可 硕f ：学何论文 综述 结合血液中9 5 9 9 的游离I G F 1 ，其主要功能是作为I G F 1 在血液循环中的载 体，防止受体下调，增强了I G F 1 的活性。一分子的I G F 1 ，一分子的I G F B P 3 ， 和一分子相对分子质量为8 8 0 0 0 的对酸不稳定的
7、蛋白质距基A L S ( A c i d l a b i l e s u b u n i t ) 共同构成了个复杂的三元复合体【1 8 】。三元复合体分子量大、为1 5 0 K D ， 不能自由在血管| 1 日J 出入、防止I G F 1 迅速流出血液，相对稳定I G F l 在血液中的浓 度，从而延长I G F 1 的半衰期寿命、使血液中游离的I G F 1 仅8 m i n 半衰期，在形 成”I G F l I G F B P s - A L S ”三元复合物后半衰期增加到了1 5 h 。出于在血液中只有游 离的I G F S j 。能发挥生物学效应、所以当组织需要I G F s 作用时、
8、”I G F 1 I G F B P s A L S ”三元复合物在一种蛋白酶的作用下、”I G F 1 I G F B P s A L S ”中的 I G F B P s 被水解成为I G F s 低亲和力的I G F B P s 片段，从而I G F 1 从”I G F 1 I G F B P s A L S ”中游离出来i 这将更有助于I G F 1 顺利到达靶器官、更强的发挥其 生物学效应。 二、糖尿病与阿尔茨海默病发病 在阿尔茨海默病发病机制中、胰岛素样生长因子1 其所介导的信号系统与 A D 的研究是建立在S A D 与糖尿病( D M ) 之间的关系研究基础上的。在研究2 型糖尿
9、病与A D 发病关系时，学者们发现散发性A D ( A S D ) 伴有糖的代谢紊乱， 胰岛素抵抗( 各组织器官对胰岛素的敏感性下降) 是其的一个显著特征，又是 A D 发病的重要危险因素。 瑞典的x ul ”】等研究表明，有糖尿病基础病的患者发展成痴呆症和A D 的危 险性接近7 0 W h i t m e r 弄 N J o s e p h 2 0 】的研究表明，2 型糖尿病的患者和A D 的危险性 也相应J 下相关性关系最近研究证实长期使用糖皮质激素的老年猕猴额叶和海 马部位胰岛素降解酶( i n s u l i nd e g e n e r a t i o ne n z y m eI
10、D E ) 的表达减少，导致脑内 A p 4 2 井高，血浆中的A D 4 2 降低【2 1 l ，说明胰岛素抵抗可以通过导致高皮质醇血症 参与S A D 的发病机理。 胰岛素增敏剂罗格列酮能改善A D 的认知功能，具有瓜的慢性高胰岛素血 症患者以及空腹及餐后血胰岛素水平增高的正常人，其认知功能减退甚至痴呆发 生的危险性均显著增高。M o r e i r a 2 2 】等在研究糖尿病和A D 的发病关系实验中揭 示：胰岛素抵抗可以导致神经元线粒体功能紊乱从而引起大脑退行性疾病、在糖 尿病和A D 两者关系中扮演了重要的角色。 2 3 I B i e s s e l s 等通过实验发现，胰岛素抵
11、 抗可以导致胰岛素信号传导通路改变，胰岛素能直接改变突触的可埋性和学习记 忆【2 4 l 【2 5 】甚至有学者提出将A D 称作“3 型D M ”假说 2 6 - 2 7 】。国内学者证明：脑内胰 岛素不仅有调节新陈代谢、影响摄食、促进神经组织生长发育、参与神经递质的 释放调节的功效，还有对学习和记忆等高级智能活动方面发挥重要作用f 2 引。生物 学研究目日i 已揭示，胰岛素对分予和细胞的作用存在着失常，这可能可能是A D 硕 ：学f 节沦文 综述 的病理基础。已有大量文献证明I G F I 同样具有促进骨形成、肌肉糖摄墩、蛋白 合成、神经，生存及髓鞘合成作用、I 问时也具有类似胰岛素的代谢
12、作用及促有丝分 裂生物学效应，即具有短期胰岛素样效应和长期的促细胞分化和增殖的效应。 S o n n a g 的实验表明I G F I 具有促进神经突触形成并维持神经细胞功能的作用，呵 改善老龄动物的记忆，学习能力1 3 。 三、胰岛素样生长因子与阿尔茨海默病发病 3 1I G F - 1 与A D 的关系 近年来，I G 卜l 在A D 中的研究地位日益受到重视。众多研究揭示，I G F l 在A D 的发病机制中发挥至关重要的作用。1 3 l 】在体外研究中证实，I G F 1 及其受体 不仅有抑制神经元凋亡的作用，而且能维持乙酰胆碱转移酶活性从而调节乙酰胆 碱的合成与释放【32 】及影响
13、B 淀粉样蛋白的合成与降解，并且抑制蛋白的高度磷酸 化，E n r i q u eJ1 3 3 1 等在研究A D 患者死后的大脑组织时发现：胆碱乙酰转移酶 ( C 拟汀) 的表达随I G F 1 及其受体的刺激而增加，从而为揭示A D 患者认知功能 障碍可能机制提供了一条广阔的研究途径。不仅这样、I G F 一1 对体内A B 的代谢 和清除也有直接作用1 3 4 1 C o s t a n t i n i 等研究证据显示：胰岛素样神经营养因子 I ( I G F 一1 ) 具有调节A p 肽的水平和促进神经元的神经保护作用。Z o n n o r B l 3 5 】研究 揭示：A D 患者
14、脑内颞叶皮层反应性胶质细胞内I G F 一1 的免疫反应产物有所增加， 而I G F 一1 基因的表达明显降低【3 州众多学者已证实胰岛素样生长因子1 不仅对血管 性痴呆有治疗作用外3 7 1 也有减少与衰老有关的认知损伤和空间记忆损伤作用【3 8 J 同时L u p i e n 等研究显示：给予胰岛素样生长因子l 抗体的大鼠学习记忆能力显著下 降，从反面支持以上的观点【3 引。 3 2I G F - 1 信号传导系统与了A D 的发病机制 研究发现，A D 其特征性病理改变与胰岛素样生长因子( i n s u l i n 1 i k eg r o w t h f a c t o r ，I G
15、 F ) 所介导的胰岛素样信号传导系统紊乱相关，其q b A l 3 的积聚和t a u 蛋白 质代谢也是胰岛素样生长因子及其受体在信号传导系统中调控的A D 两个关键病 理改变因素，从而提示胰岛素信号传导系统紊乱参与了A D 的发病机制。T o r r e s l 4 0 1 等在结合家族性疾病模型的基础上，通过建立与相关胰岛素生长因子1 的阿尔茨 海默病动物模型研究中显示：胰岛素生长因子1 和胰岛素样生长因子信号可能与 发散性阿尔茨海默病有关。胰岛素一l 严重缺陷或胰岛素样生长因子信号紊乱可能 是发散性阿尔茨海默病的病理改变的部分原因，这可能有助于澄清大家公认的初 步代谢紊乱和阿尔茨海默病
16、病理进展机制方面之问密切联系。B u m s l 4 l 】等在通过 提高外周胰岛素水平发现可降低A D e N 关的脑萎缩、认知功能障碍、学习记忆及 痴呆的严重程度，这也表明胰岛素信号传导通路在A D 的病理生理机制中起着重 要的作用 4 硕卜学f 囊论文 综述 3 2 1 胰岛素的信号转导通路与脑内A p 的代谢 研究证实，通过大鼠双侧脑室注射S T Z 干扰神经元的胰岛素信号转导通路， 可以导致大鼠空间学习记忆能力下降，同时伴有皮质、海马神经元内A B 积聚、 提示胰岛素的信号转导通路与脑内A D 的代谢存在的密切的联系【4 2 1 。也有研究显 示，I G F 1 可能参与调节A 8 的形成、，主要机制是I G F 1 及其受体通过胰岛素样生 长因子的信号转导通路调控其介导的的下游信号途径影响A D 的代谢过程，主要 包括磷脂酰激酶、3 激酶丝氨酸苏氨酸蛋白激酶( P
