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1、南方医科大学 硕士学位论文 脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的制备及治疗研究 姓名：徐越 申请学位级别：硕士 专业：神经外科 指导教师：柯以铨 20080423 硕士学位论文 脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的 制备及治疗研究 硕士研究生：徐越 指导教师：柯以铨教授 摘要 一、概述 脑胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，生长迅速，目前治疗大多为常规手术切 除并加以放疗、化疗以及免疫治疗，但由于肿瘤细胞具有侵袭能力的特征，恶 性肿瘤向周围“正常脑组织“ 浸润性生长，导致手术难以完全切除，术后复发 率高，不能改善大多数病人的预后，一般存活时间少于诊断后1 8 个月，因此探 索有效治疗方法成为神经外科
2、学的难题。随着肿瘤分子生物学的发展，研究已 证实，端粒与端粒酶是细胞分裂和增殖的基础，端粒是真核细胞染色体末端由重 复D N A 序列和蛋白质组成的复合物，正常情况下随每一轮的细胞分裂而缩短， 当端粒缩短到一个临界长度时，细胞停止分裂而衰老死亡。故端粒长度是决定 细胞增殖能力和寿命的分子标志。端粒酶是一种由h T E R T 、h T R 和h T P I 组成的 特殊逆转录酶，能以自身的h T R 为模板，通过逆转录方式催化端粒重复序列 ( T F A G G G ) 复制防止端粒的缩短，维持细胞的增殖活性，阻滞因端粒缩短诱发的细 胞衰老凋亡。端粒酶异常再活化是恶性胶质瘤细胞无限增殖和凋亡抑
3、制的根本 原因，因此作为目前已知的最广泛、特异性最高的肿瘤标记物，其活性与颅内 恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关，抑制端粒酶的活性就可有效的抑制恶性 肿瘤的发生和发展。以端粒酶为靶点，应用端粒酶抑制剂协同常规方法治疗脑 肿瘤已成为一种新策略。 目前有多种方法可抑制端粒酶，其中以反义核酸技术尤为突出，成为当前肿 中文摘要 瘤多基因治疗的研究热点，通过反义技术设计制备的反义寡核苷酸( a n t i s e n s e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ，A S O D N ) 是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达 的寡核苷酸片段，其特有的核苷
4、酸序列决定了它能与靶D N A 或靶R N A 的碱基 互补，多途径封闭靶基因的表达。已有大量研究表明，A S O D N 在体外和瘤内的 注药有明显的抑制脑胶质瘤细胞恶性增生，促其调亡作用，并能增加肿瘤细胞 对化疗药物的敏感性，对于治疗脑胶质瘤具有潜在的活力。但由于A S O D N 为多 聚阴离子，而细胞膜上带一定的负电荷不易透过细胞膜、且在转运过程中还易 被核酸内切酶迅速降解。因此需要一种载体来协助运载。 纳米粒( n a n o p a r t i c l e sN P ) 作为新型给药体系，一般指粒径在1 “ - - 10 0 0 n m 的粒子，是一类高分子物质材料，药物可以溶解、
5、吸附或包裹于材料中，具有尺 寸效应、表面效应、易吸收等生物优势。当前纳米技术在靶向给药和医用高分 子材料研究领域的应用日益广泛，通过这种技术，国内外已有多种方法将 A S O D N 吸附镶嵌在N P 表面来增加其对肿瘤细胞的转染和稳定性，但体内给药 后，效果并不理想。为此需要寻求一种有效纳米载药材料来包裹，协助运载保 护A S O D N 。 二、研究目的 本研究优选可降解的高分子材料a 氰基丙烯酸正丁酯( b u t y l e y a n o a c r y l a t e B C A ) 为制备N P 的载体，采用界面聚合法，A S O D N 为模药，通过优化工艺，包 裹制备载药纳米
6、粒( A S O D Ni I lN P ) ，并制成冻干品后，考察其稳定性，将其转 染C 6 脑胶质瘤细胞，观察其对细胞抑制的影响。 三、主要研究方法、内容和结论 第一部分 A S O D Ni nN P 制备工艺的优化：本实验以可降解的高分子材料BcA 为制 备N P 的载体，A S O D N 为模药，采用界面聚合法，以N P 的粒径和粒径分布为 主要控制指标，通过相关文献和预实验确定单因素。根据单因素试验结果，优选 A S O D N 浓度、p H 值及T w e e n 8 0 量3 个主要因素，每个因素选择3 个水平，按 硕士学位论文 正交试验设计原理用正交设计表b ( 3 4 )
7、 安排试验，以粒径、载药量、包封率为考 察指标，优化N P 的制备工艺，筛选处方，确定最优制备条件：A S O D N 浓度为 5 O 1 0 击m o l L 、p H 值为8 0 及T w w e e n 8 0 用量为1 2 5 9 。 第二部分：A S O D Ni nN P 性质的研究、纯化及冻干工艺的考察。 按照最优条件所制备3 批N P 混悬液为均匀半透明状分散系，体系略带乳 光，包封率( E E ) 、载药量( D L ) 分别为9 6 6 7 ：1 ：1 4 5 ，1 0 1 0 3 5 ；取N P 混 悬液适当稀释后，用激光粒度分析仪测定三批样本的平均粒径为9 4 9 6
8、2n l n ， 多分散度为O 0 5 0 0 1 2 ，说明粒径分布均匀，透射电镜下观察，见粒子形状规 则，大小均匀，无粘连；对载药纳米制剂的纯化工艺进行了考察，试验结果表 明：采用超速冷冻离心法，在4 。C 时以2 0 0 0 0 r p m 的转速离心3 0 m i n ，洗涤离心 三次能达到很好的纯化效果；对A S O D Ni nN P 冻干工艺考察结果表明：以5 乳糖为冻干保护剂，冷冻干燥样品可以得到光滑圆整的A S O D Ni n N P 冻干品。，。 第三部分：A S O D Ni nN P 稳定性性研究。 采用加速试验，在温度( 4 0 2 ) ，湿度( 7 5 5 ) 的
9、条件下考察了三批 A S O D Ni n N P 冻干品的稳定性，一共考察3 个月，分别于0 、1 、2 、3 月取样。 检测项目包括性状、鉴别、检查，具体考察项目为外观色泽、P H 值、粒径、包 封率、载药量、再分散性、再分散后的澄明度等。作为对照，在室温下考察 A S O D Ni nN P 混悬溶液的稳定性三个月，考察项目同上。结果：在加速试验考 察期内，A S O D Ni nN P 冻干品的外观色泽变化不大，p H 在规定范围内，粒径、 包封率、载药量均无明显改变，再分散性良好，澄明度合乎要求。三批A S O D N i nN P 混悬液在室温稳定性试验考察期内，可见粒径逐渐增大，
10、包封率和载药 量逐渐减小，混悬液颜色逐渐变混变深，并有絮凝现象出现。说明随着时间的 推移，A S O D Ni nN P 混悬液不稳定。说明将A S O D Ni nN P 混悬液冷冻干燥后， 可大大提高其稳定性。 按照最优制备工艺方法制备A S O D Ni nN P ，同时将传统的A S O D N 吸附 在N P 表面( A S O D N - N P ) 和游离A S O D N ( F R E EA S O D N ) 作为对照。上述 中文摘要 溶液与小牛血清混合，置于恒温水浴箱中3 7 0 C 水浴；灭活血清酶后；加入4 m m o l L 的N a O H 溶液适量。然后采用含7
11、M 尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电 泳分析，用E B S 进行染色，将凝胶置于紫外光下，显影照相。实验结果：A S O D N i n N P 样品有明显的亮条带，亮条带为游离的A S O D N ，F R E E A S O D N 则没有亮 条带，A S O D N - N P 样品，亮度不及A S O D Ni nN P 样品，说明F R E EA S O D N 已 完全降解，A S O D N 被包裹制备的N P 能够有效的保护A S O D N 不被血清中的核 酸酶降解，这种保护作用明显优于传统的通过离子相互作用将A S O D N 吸附在聚 合物表面制备的N P 。 第四部分：A
12、 S O D Ni nN P 对C 6 胶质瘤细胞的抑制作用。 本实验分5 个组：A 组仅加入培养液的空白对照组；B 组未加A S O D N 的 空白N P 组( B C A 加) ；C 组游离A S O D N 组( F R E EA S O D N ) ；D 组传统吸附 制备的N P 组( A S O D N N P ) ；E 组本实验制备的包裹A S O D N D 的N P 组( A S O D N i n N P ) 。 1 流式细胞术检测细胞周期：取对数生长期的C 6 细胞于2 4 孔板中传代培 养2 4 h 后，加入上述各实验组转染4 8 h 后，制成流式细胞检测样品后，上流式
13、 细胞仪进行细胞周期分析。流式细胞仪检测结果发现，转染后与对照组相比， 除B C A - N P 外，其他各组细胞周期均发生显著变化，其中A S O D Ni nN P 组差异 非常显著职0 0 1 ) ，表现合成前期( G o G 1 ) 期细胞比例显著增高，D N A 合成期 ( S 期) 细胞比例减少；与传统的吸附法制备的N P 相比，A S O D Ni n N T 组也表 现出显著性差异( p B C ，关键因素是A ，粒径越小越优，得最优水平组合是：A 2 8 3 C 1 ； 影响载药量的关键因素是B ，载药量越大越优，得最优水平是B 3 ：对包封率来 说，影响的关键因素A ，包封
14、率越大越优，得最优水平是A 2 ，其他为次要因素。 为避免试验误差对结果准确性的影响，将粒径、载药量、包封率分别用 S P S S l l 5 软件处理，进行方差分析检验，结果见表1 1 2 、表1 1 4 、表1 1 6 。从 表中方差分析结果可知，A S O D N 浓度对粒径有显著性影响，p H 值对载药量有显 著性影响，三个考察因素对包封率均无显著影响。 综合直观分析和方差分析结果，最终选定最佳工艺条件为A 2 8 3 C 1 。即 A S O D N 浓度为5 0 X1 0 击m o l L 、p H 值为8 0 及T w w e c n 一8 0 用量为1 2 5 9 。 1 4
15、3N P 中A S O D N 含量测定结果 1 4 3 1 标准曲线 A S O D N 在紫外扫描中得紫外吸收扫描图谱，确定A S O D N 的最大吸收波长 为2 6 0 n m ，扫描曲线见图l 。 按色谱条件，线性回归所得回归方程：A = 1 2 6 5 6 6 C 一1 9 3 4 ( r - - - 0 9 9 9 9 ) ，可见 A S O D N 在浓度0 1 2 5 1 0 r 6m o l L 到1 0 0 0 0 X1 0 r 6m o l L 范围内，C 与A 线形关 系良好，标准曲线见图2 。 1 4 3 2 回收率的测定结果 此方法测定的回收率见1 1 8 。表中
16、可见该法的回收率符合分析要求。 1 4 3 3 精密度及重现性试验结果 测得日内平均回收率为( 9 8 9 8 士O 4 1 ) ，R S D 为0 4 1 ，日间平均回收率 为( 1 0 0 0 2 士0 3 8 ) ，R S D 为0 3 8 。结果见下表1 1 9 。表中可见精密度符合 分析要求。 硕士学位论文 表1 1 8A S O D N 回收率的测定结果( n = 5 ) ( z 士S D ) T a b1 18R e c o v e r ya n dR S Df o rt h ea n a l y s i so f A S O D N ( n = 5 ) ( X 士S D ) 表1 1 9A S O D N 精密度的测定结果 T a b1 - 19A c c u r a c ya n dp r e c i s i o nf o rt h ea n a l y s i so f A S O D N 1 4 3
