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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 自体骨髓源性肝干细胞体外扩增后移植治疗肝炎后肝硬化 的临床研究 A u t o l o g o u si n t r a h e p a t i ct r a n s p l a n t a t i o no fb o n em a r r o wd e r i v e d l i v e rs t e mc e l la f t e re x p a n s i o ni nv i t r oo np a t i e n t sw i t h p o s t h e p a t i t i cc i r r h o s i s 课题来源：广州市科技
2、攻关计划项目( 2 0 0 7 2 3 一E 0 3 7 1 ) ； 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 肝胆外科 秦安成 廖彩仙教授 黄宗海教授 霍枫教授 陈亚进教授 彭宝岗教授 林建华副教授 论文评阅人殷晓煜教授 元云飞教授 杨定华教授 2 0 1 0 年0 4 月0 7 日广州 硕士学位论文 自体骨髓源性肝干细胞体外扩增后移植治 疗肝炎后肝硬化的临床研究 硕士研究生：秦安成 指导教师：廖彩仙教授 摘要 目前肝移植是治疗末期肝病的一种有效的治疗方法，但由于供体缺乏、免 疫排斥和高额费用等一系列的问题，以至于肝移植的临床运用受到限制，难以 满足众多的肝病患者治疗的
3、需求。众多的肝病学家们也一直在探索一种可以补 充的甚至于能够代替肝移植来治疗肝脏疾病的方法。随着细胞学等相关学科的 发展，使得应用肝干细胞来治疗肝脏疾病成为可能。肝干细胞可以分化为与其 自身的基因一致的肝细胞及胆管细胞，作为肝干细胞的一种，骨髓源性肝干细 胞( B o n em a r r o wd e r i v e dl i v e rs t e mc e l l s ，B M D L S C ) 的发现，为肝脏疾病治疗 提供了新的思路和手段。利用骨髓源性肝干细胞移植的方法来修复因疾病而损 伤肝脏，这是一种全新的肝病治疗方法，该技术可以修补因等各种原因损伤而 减少的肝细胞数量，可以重建因为
4、肝损伤而遭到破坏的肝脏的组织结构。 近年来，国内外已有众多专家在研究如何利用肝干细胞来治疗肝硬化等终 末期肝病的课题。取得了一定的成果，但也存在许多尚待解决的问题。在现有 的文献资料中，绝大多数学者所采用的技术路线是：直接将抽取的骨髓进行肝 动脉或门静脉输注移植，或者将骨髓进行简单的离心分离后再经肝动脉或门静 脉输注移植。这种直接利用骨髓源性肝干细胞进行移植的技术路线，虽然在方 法上相对简单易行，但最终效果都不够理想，原因是B M D L S C 在骨髓细胞中的含 量非常稀少，即使移植较大量的骨髓，B M D L S C 的移植数量也往往不足。我们采 用的技术路线是骨髓源性肝干细胞经体外培养扩
5、增后再行肝内移植。这种技术 路线在我们的前期动物实验已经证实是安全有效的，可以增加可供移植细胞中 中文摘要 B M D L S C 的数量，可以减少B M D L S C 移植的骨髓需要量，从而提高B M D L S C 移植的 肝病治疗效果。 自2 0 0 4 年开始探索利用骨髓源性肝干细胞修复肝脏疾病损伤的研究，建立 了骨髓源性肝干细胞在体外培养、扩增的有效技术，可以有效的增加骨髓源性 肝干细胞的移植数量，使移植细胞的数量和移植细胞定居在肝脏并发挥治疗作 用的数量都得到增加。本研究主要观察临床应用自体骨髓源性肝干细胞体外扩 增后肝内移植治疗肝炎后肝硬化的安全性与有效性。 目的 探索临床自体
6、骨髓源性肝干细胞在体外培养与扩增后肝内移植治疗肝炎后 肝硬化的安全性及其效果。 材料和方法 1 病例选择：2 0 0 8 年1 月至2 0 0 9 年4 月入住南方医院肝胆外科治疗的肝 炎后肝硬化患者中，符合入选条件的病人1 2 例，其中女性3 人、男性9 人，平 均年龄4 8 8 岁( 3 9 6 0 岁) 。病人按入院先后的半随机方法分为治疗组6 例和对 照组6 例。所有的病人都有明确的乙肝病史，肝功能检查轻度至中度异常， C h i l d P u g h 肝功能评分A C 级，组织病理学检查显示肝内广泛的纤维组织增生， 肝小叶结构被破坏，假小叶及再生结节形成，符合临床肝炎后肝硬化的诊断
7、标 准。 2 自体骨髓源性肝干细胞的采集、体外培养与扩增：治疗组患者在接受脾 切除、门奇静脉断流术治疗前一周，在严格无菌操作条件下以髂后上棘为穿刺 点行骨髓穿刺术抽取骨髓3 0 4 0 m L ，并用肝素盐水抗凝后，送专门的实验室进行 骨髓源性肝干细胞的分离、体外培养、扩增；在无菌的细胞培养室中利用密度 梯度离心法分离出富含C D l l 7 阳性细胞和C D l 8 4 阳性细胞的骨髓单个核细胞群， 然后将细胞在体外培养扩增7 天，扩增方案采用含1 0 自体血清的高糖D M E M 培 养基体系中加促肝细胞生长素( H G P F ) 、促血小板生长素( T P O ) 和白细胞介素 3 (
8、 I L 3 ) ，此方案在严格无菌的层流细胞培养室中完成；将细胞制成细胞悬液， n 细胞和C D l 8 4 阳性细胞的数量变化。 3 体外扩增的自体骨髓源性肝干细胞的肝内移植：在患者接受门奇静脉断 流术中缝合关闭腹腔前，治疗组中，以l m L 注射器针头穿刺肝固有动脉，经肝 动脉缓慢注入经体外培养与扩增处理的自体骨髓源性肝干细胞悬液( 体积1 0 毫 升，细胞平均浓度0 5x1 0 7 m 1 ) ，对照组经肝动脉缓慢注入等体积的生理盐水。 术前术后两组病人予以相同方案的预防感染、保护肝脏与对症支持等治疗。 4 观察指标与方法 4 1 症状与体征：内容包括精神、食欲、体力、黄疽、腹水、下肢
9、水肿、肝 性脑病等。 4 2 、影像学检查：术前及术后3 个月行肝脏C T 及B 超检查，依据C T 所示 肝脏体积和肝脏密度( C T 值) 来评定肝硬化的程度及其变化。 4 3 、实验室检查t 术前及术后3 个月分别检查( 1 ) 肝功能：丙氨酸氨基转 移酶( A L T ) 、门冬氨酸氨基转移酶( A S T ) 、血清白蛋白、血清总胆红素；( 2 ) 凝血功能：凝血酶原时间；( 3 ) 肝纤维化指标：透明质酸( H A ) 、人I I I 型前胶 原( H P C I I I ) ，此外我们还记录了患者在移植术后的2 周及1 个月的上述的实验 室检查结果，但此数据受影响的因素较多，只能
10、作为临床参考所用。 5 统计学分析 数据以X S D 表示，采用S P S S l 3 0 软件进行分析，检验水准：a = 0 0 5 。对 一般情况的性别、术前的人I U 型胶原蛋白术前术后人I I I 型胶原蛋白变化值因 不服从正态分布而采用非参数的秩和检验、性别构成采用霜检验，术前术后的 A S T 、A L T 、T B I L 、A L B 、P T 、透明质酸、术后的人I I I 型胶原蛋白及其余各项 指标的前后的差值均服从正态分布而采用独立样本的t 检验及配对t 检验。 结果 l 、患者术后3 月均自觉症状较术前明显好转，水肿、黄疸、腹水的体征亦 较术前有不同程度的缓解。 I I
11、 I 中文摘要 2 、两组病人术前的各项检验均无统计学差异，两组病人的术后均未发现手 术并发症，治疗组6 例病人均未发生过敏反应、排斥反应和其它不良反应。 3 、肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血浆白蛋白、凝血酶 原时间：治疗组由( 3 9 1 5 ) U L 、( 6 4 2 1 ) U L 、( 4 2 5 1 3 2 ) u m o l L 、( 2 9 8 5 1 ) g L 、( 1 5 1 1 7 ) S 变为( 2 4 1 0 ) U L 、( 3 8 1 6 ) U L 、( 2 3 5 5 5 ) u m o l L 、( 3 4 2 5 0 ) g L 、( 1
12、 3 7 1 1 ) s ；对照组由( 3 8 8 ) U L 、( 5 5 2 1 ) U L 、( 3 1 0 9 9 ) u m o l L 、( 3 0 0 2 6 ) g L 、( 1 5 0 1 2 ) S 变为( 4 0 1 3 ) U L 、( 6 3 2 1 ) U L 、( 2 9 1 9 5 ) u m o l L 、( 2 8 。2 2 7 ) g L 、( 1 5 9 2 1 ) S ，治疗组优于对照组( P 0 0 5 ) 。 3 、讨论 肝硬化是常见的终末期肝病之一，其中一部分最终发展为肝癌。在我国目 前肝硬化的最主要的原因仍然是慢性病毒性肝炎。其他还有如酒精及其
13、代谢物、 嗜肝病毒、实验造模用的C C L 4 、放射线等。本课题选取慢性乙型病毒性肝炎后 肝硬化患者作为观察对象，其具有典型性，才外还可以尽量减少非控制因素对 研究结果的影响。 肝硬化起病长较隐匿，进展缓慢，肝脏又有较强的代偿功能，所以在肝硬 化的发生后一段较长时间内，甚至数年内并无明显的症状和体征。在肝硬化早 期，患者常有食欲不振，消化不良，腹胀，恶心，大便不规则等消化系统及乏 力、头晕，消瘦等不适，当肝硬化进一步恶化至失代偿阶段时，上述症状加重， 并可出现水肿、腹水、黄疸、皮肤粘膜出血、发热、肝昏迷、无尿等症状，肝 7 第一章病例选择、肝功能指标的检测 硬化患者面色灰暗，缺少光泽，皮肤、
14、巩膜黄染，面、颈和上胸部可见毛细血 管扩张或者蜘蛛痣，手掌的大小鱼际和指端常有红斑称为肝掌，男性常有乳房 发育并伴有压痛。在本研究中，患者均有不同程度症状和体征，其中以乏力和 腹水以及消化系统症状最为明显。 病理学检查目前仍然是肝硬化确诊的金标准，肝硬化的病理学改变以肝组 织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成为主要特征。本次研究的对象的病理 检查发现肝组织基本弥漫纤维化较明显，假小叶、增生的结节较多，患者有明 确的乙肝病史，并且实验室检查亦提示为乙肝患者，并未发现其他损害肝脏的 疾病，符合肝炎后肝硬化的病理诊断标准。 影像学检查对患者术前诊断及手术机会评估的作用可以说是不可或缺的。B 超对肝硬
15、化诊断一定价值。超声检查同样可以明确肝脏形态、肝表面光滑度及 肝叶结构的改变情况，对腹腔积液的诊断有更简便易行的优点。进行彩色多普 勒超声检查发现，肝硬化的肝脏实质回声不均，呈弥温性增强，肝内血管壁回 声减少或显示不清；门脉主支径均增宽，血流速度变缓、频谱低平。C T 检查对 于中晚期的肝炎后肝硬化患者更具有价值，中晚期肝硬化患者肝脏在C T 上多数 表现为体积缩小；肝轮廓呈结节状凹凸不平改变；肝叶比例失常，常常表现为 尾叶和左叶增大，而右叶缩小：肝门及肝裂增宽；肝实质不均，肝硬化结节性 在平扫中呈高密度。在本研究中，我们以门脉的一级分支平面为基准作为测算 肝脏体积。此外，几乎肝炎后肝硬化患者
16、均有不同程度的腹腔积液形成。早期 肝硬化的C T 扫描表现出来。 实验室血清学肝脏功能检查对于肝脏疾病患者的治疗有着重要的临床意 义。肝纤维化的检测对肝硬化的程度有重要的参考意义。肝纤维化的血清学评 估包括透明质酸( H A ) 、层粘连蛋白( L N ) 、I V 型胶原( C ) 、I I I 型前胶原肽 ( PI I I N P ) 等，其中H A 是最具临床实用价值的指标，它可反映肝纤维化的程度 有重要临床意义。肝功能血清指标有谷丙转氨酶( A S T ) 、谷草转氨酶( A L T ) 、 谷草谷丙转氨酶的比值( A S T A L T ) 、总蛋白( T P ) 、白蛋I 圭t ( A L B ) 、球蛋白( G ) 、 硕士学位论文 白球蛋白的比值( A G ) 、总胆红素( T B I L ) 、直应胆红素( D B I L ) 、间应胆红素 ( I B I L ) 、前白蛋白( P A ) 、碱
