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1、第4 4 卷专辑西北师范大学学报( 自然科学版)5 1 9 肾上皮细胞损伤后分子结构的变化及其诱导 草酸钙结石形成的机理 杨如娥，欧阳健明。 暨南大学生物矿化与结石病防治研究所，广州( 5 1 0 6 3 2 ) 关键词：肾上皮细胞损伤；活性氧蔟；乳酸脱氢酶 从化学的观点看，肾结石的形成至少与三个因素密切相关：( 1 ) 尿液中尿石盐的过饱 和；( 2 ) 抑制剂浓度或活性降低，促进剂浓度增加；( 3 ) 肾上皮细胞膜表面的损伤，使 晶体滞留在肾脏中。 过饱和是肾脏中晶体形成的动力；而只有当肾脏损伤和肾功能异常等肾脏病理的改变 才能使晶体粘附并在肾脏中停留。草酸作用于细胞是肾结石形成的一个最重
2、要的因素。草 酸能对肾上皮细胞产生毒性，包括改变膜的表面性能、细胞脂质、基因表达等，破坏线粒 体功能，形成活化氧簇( R o S ) 。在肾脏中，草酸钙晶体能堵塞肾小管，扰乱细胞功能， 并杀死邻近细胞K J 。 细胞和动物活体实验均表明，近端肾小管细胞在草酸或草酸钙晶体作用下会诱导细胞 膜的损伤1 3J 。细胞膜损伤能诱导活性氧簇产生、导致乳酸脱氢酶过度释放【2 J 和脂质过氧化 p l 、细胞凋亡【4 1 和晶体粘附等。活性氧簇的产生有研究表明可以通过自由基清除剂如抗氧 化酶、抗氧化剂( 硒和维生素E 等) 来清除过度产生的自由基，抑制活性氧簇对上皮细胞 的氧化作用。有研究表明，尿粘蛋白(
3、2 】、Q u e r c u s 翰l i c i n aB I 啪e 提取物 4 b 】等对乳酸脱氢 酶的过度释放有抑制作用。脂质过氧化通常是通过测定丙二醛的含量来反映脂质的过氧化 程度。而细胞凋亡可以通过半胱天冬酶9 、B a x 2 基因家族等的蛋白质表达和半胱天冬酶3 的活性变化来衡量的。 1 活性氧蔟的产生 自由基、带有未配对电子的原子或分子，以及他们的代谢物统称为活性氧簇( r e a c t i v e o X y g e ns p e c i e s ，R o S ) 。肾小球内活性氧簇是生物体内有氧代谢过程中产生的活性产物，主 要包括超氧自由基、过氧化氢，氢氧自由基，单线态
4、氧，过氧化脂类等。活性氧蔟的标准氧化 还原电位高，氧化能量强，具有一定毒性【2 l 。 肾上皮细胞在草酸、草酸钙晶体或者高草酸尿作用下，能导致活性氧簇的产生，但是 如果草酸或草酸钙晶体浓度过高就会导致活性氧蔟的量超过了内生抗氧化剂的抵御能力， 于是引起了肾脏的氧化应激并最终导致肾脏的损伤。活性氧簇还能引起细胞凋亡或坏死， 细胞增殖，产生结晶化调节剂和化学趋化作用l 。 2 乳酸脱氢酶( L D H ) 释放量显著增加 乳酸脱氢酶( L D H ) 是细胞内标志性酶，其化学和生物性质十分稳定。通常情况下乳酸 基金项目：国家自然科学基金( 2 0 4 7 1 0 2 4 ，3 0 6 7 2 1
5、0 3 ) 、教育部留学回国人员科研启动基金( 教外司 1 2 0 0 5 1 5 5 号) 联系人：T c l ：0 2 0 8 5 2 2 3 3 5 3 ，E m a i l ：! Q 埘盟囝叫：地：鳃 5 2 0 全国第f 一四届人环化学暨第六届超分子化学学术研讨会论文专辑 脱氢酶的漏出很少，它的释放与细胞膜的完整性相关，且释放量与细胞受损程度呈正相关。 因此，测定乳酸脱氢酶的释放量可以反映出细胞的受损伤程度。草酸能显著增加乳酸脱氢 酶的释放量，这说明了草酸能诱导细胞损伤。 H s i e hN 掣2 】发现草酸作用于M D C K 细胞2 h 能引起乳酸脱氢酶释放量的显著增加，在4
6、h 时乳酸脱氢酶释放量继续增加。当用一水草酸钙晶体( C O M ) 处理2 h 和4 h 时，乳酸脱氢酶 释放量显著增加。 加入一系列浓度的尿粘蛋白( T a m m H o r S f a I lP r o t e i n ，T H P ) 后发现，T H P 只有在高浓 度时才能减少草酸诱导自由基的产物。而当T H P 用唾液酸酶去糖基后，不管是在高浓度还 是低浓度下，用草酸处理2 h 还是4 h 都不会减少乳酸脱氢酶的释放量。加入C O M 后结果也是 一样的。这也说明了M D C K 细胞中糖基化是抑制草酸诱导超氧化基产生的重要过程并起着 重要作用“J 。 3 丙二醛( M D A
7、) 量增加 丙二醛( m a l o n d i a l d e h y d e ，M D A ) 是细胞脂质过氧化反应的终产物，其含量的多少可以反 映脂质过氧化的程度，也间接地反映出细胞受损的程度。脂质过氧化作用不仅把活性氧转 化成活性物质( 即非自由基性的脂类分解产物) ，而且通过链式和链式支链反应，放大活性 氧的作用 3 b 】。 H s i e hN 等发现M D C K 细胞在草酸作用下，能导致M D A 含量的显著增加，加入C o M 后则进一步增加。用草酸和尿粘蛋白( n P ) 联合处理发现T H P 在2 0 0 n M 和5 0 0 n M 在处 理2 h 和4 h 都能显
8、著减少M D A 。如果M D C K 细胞用草酸和C O M 联合处理，则T H P 只有 在5 0 0 n M 时才有显著的抑制作用f 2 】。这也表明了草酸对细胞有损伤作用，而T H P 则能抑制 细胞的损伤。 4 细胞凋亡 细胞凋亡( a p o p 瞳0 s i s ) 又称为程序性细胞死亡，是细胞主动的衰老和死亡方式，与病 理情况下的细胞主动死亡不同，凋亡的细胞周围没有炎症反应，因为细胞凋亡过程中细胞 内的细胞器不发生裂解，细胞内容物不外漏，而是通过启动特定的基因，使原来完整的细 胞膜向外皱缩形成凋亡小体，巨噬细胞或邻近的细胞可吞噬这些凋亡小体进入体循环f 6 J 。 一种众所周知
9、的细胞凋亡机理是半胱天冬酶9 的活化作用，而细胞凋亡反过来活化其 他的半胱天冬酶。这些半胱天冬酶的活化作用导致细胞死亡。而半胱天冬酶9 的活化作用 要求有细胞色素C 从线粒体流向细胞溶质。B c l 2 基因家族( 如B a ) 【蛋白、B c l 蛋白和B c l 】( L 蛋白等) 则能控制细胞色素C 的释放【l d l 。 5 草酸钙晶体的滞留 H s i e hN 等发现M D C K 细胞用草酸和一水草酸钙( C O M ) 晶体和5 0 0 n M T H P 联合处 理4 h ，与未加入尿粘蛋白( m P ) 的细胞相比较，粘附到细胞膜上的晶体数量显著增加。 M D c K 细胞
10、用草酸和C O M 晶体和5 0 0 n M D T H P 联合处理4 h 发现细胞有严重的损伤和细 胞粘附【2 】o L i e s k e 等一J 研究了延长四种细胞线暴露到草酸中的时间( 2 4 、4 8 、7 2 h ) ，在各个浓度 ( O 5 2 0 m M ) 时的作用，并使用c y Q u a n t 试剂进行荧光测定，发现，较高浓度的草酸时， L L c P K l 细胞的数量在2 4 h 和4 8 h 后的细胞数量都比对照实验的细胞数量少，而在7 2 h 时 第4 4 卷专辑西北师范大学学报( 自然科学舨) 5 2 l 则与对照实验相似：而c I M C D 细胞的数量在
11、2 4 h 时的细胞数量比对照实验的细胞数量少， 而在4 8 h 和7 2 h 时则没有；而H R C l 细胞的数量在2 4 h 和4 8 h 时的细胞数量比对照实验的 细胞数量少：K N R K 细胞的数量在2 4 h 时减少了，但在0 5 m M 的草酸中7 2 h 时却显著地高 于对照实验【5 b 】。 6 结语 正常人和尿石患者的尿液中均含有大量的尿晶体。这些晶体只有粘附到肾小管上皮细 胞上变为固定的颗粒之后，才能长大并形成结石。正常人的尿晶体能够被肾小管液冲走，因而 不形成尿石：而尿石患者由于其肾小管上皮细胞膜损伤，导致尿石晶体的滞留和粘附，最终形 成结石。因此，要预防尿石的形成，
12、减少肾小管上皮细胞膜与尿晶体的粘附是关键之一，而减 少粘附的有效途径之一是修复受损伤的肾小管上皮细胞膜【1 h 】。因此了解肾上皮细胞损伤后 结构变化是非常必要的。我们希望能够通过了解肾上皮细胞损伤后分子结构的变化和其诱 导草酸钙结石形成的化学机制，建立修复细胞膜和抑制晶体形成的的方法。我们近期的工 作将是通过损伤培养的肾上皮细胞，找出损伤前后肾上皮细胞结构、形态等的变化及检测 细胞损伤前后反映细胞损伤的各种因素的变化，如乳酸脱氢酶、丙二醛和自由基等的量的 变化，以期找到新的预防和治疗肾结石的方法。 参考文献 f 1 1K h 绷SR 聊D ，忍s ，2 5 ，3 3 ：3 4 蝎5 7 嘲H
13、 s i e h N ，s h i h C H ，C h H Y ，W uM - C ，C h c nW C ，L i C - W 酚o f 鼬。2 0 0 3 ，3 l ：l m l 6 3 1 M o FD ，M a 晦i I I iM ，T w o I i n iIM ，M a r c oVD ，B 笛s iP U ，加t ，2 0 0 5 ，7 4 ：1 9 3 1 9 7 【4 】o u y 锄gJ MD 蜘gs P c D f ，盯彳2 7 ，i I lp r I 潞 【5 】李成文，孙光，邓耀良，李慧忠，常峰广西医学2 0 嘶，2 8 ( 4 ) ：5 0 3 5 0 5 【6 】G r e 嘶e E L ，F a r c U Q Y u S ，M 礤h e w sT K u m 缸v ，L i c s k eJ C 曲D f 丑2 5 ，3 3 ：3 4 啦3 4 8 阴 邓穗平，欧阳健明江西医学院学报2 5 ，4 5 ：1 6 5 - 1 6 7
