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1、实验一 无菌操作技术【用接种环挑取菌种】（1） 左手持细菌斜面培养物，右手持接种环，将接种环进行火焰灼烧灭菌（烧至发红），然后在火焰旁打开斜面培养物的试管帽（管帽不能放在桌上），并将管口在火焰上烧一下；（2） 在火焰旁，将接种针轻轻插入斜面培养物试管的上半部（此时不要接触斜面培养物），至少冷却5s后，挑取少许培养物（菌苔）后，再烧一下管口，盖上管帽并将其放回试管架中；（3） 用左手迅速从试管架上取出A管，在火焰旁取下管帽，管口在火焰上烧一下，将沾有少量菌苔的接种环迅速放进A管斜面的底部（注意：接种环不要碰到试管口边）并从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，同样烧一下试
2、管，盖上管帽，将接种环在火焰上灼烧后放回原处。如果是向盛有液体培养基的试管和三角烧瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。实验二 培养基的制备消毒与灭菌【培养基配制实验原理】培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。【培养基配制要素】营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐；适宜的酸碱度和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位。【培养基的分类】根据培养基成分，可分为天然培养基和合成培养基（天然培养基主要成分是复杂的天然有机物质，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦
3、芽汁培养基、LB等；合成培养基用化学成分完全了解的纯化合药品配制而成的培养基，如高氏一号培养基和查氏培养基）。根据物理状态，可分为固体培养基（加入凝固剂，如1.5%2.0%琼脂）、半固体培养基（加入少量凝固剂，如0.2%0.7%琼脂）、液体培养基（不含任何凝固剂）。根据培养基用途，可分为基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）、营养培养基（加富培养基）（添加了血清、血液等）、鉴别培养基（含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。如酪素培养基、伊红美蓝培养基）、
4、选择培养基（利用微生物对某种化学物质的敏感性不同。在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如无氮培养基、马丁氏培养基）。加富培养基与选择培养基的区别加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使其需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。【培养基制备步骤】称量，溶化，补充水分、调pH，过滤，分装，加塞，包扎，灭菌，搁置斜面，无菌检查。【培养基制备注意事项】1、 称量药品时，严防药品混杂。称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称取另一
5、药品。瓶盖也不要盖错。2、 药品不要弄错。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。3、 培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。4、 对于微量成分，可以先配制成高浓度的储备液，按比例换算后再加入。5、 琼脂溶化过程中，要控制火力并不断搅拌，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。6、 不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基。7、 调pH值前先补足水分。8、 pH不要调过头，以免回调影响离子浓度。9、 固体分装不超过试管高度的1/5，不超过三角烧瓶容积的
6、一半。10、 分装过程中，注意不要将培养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起的污染。11、 配好培养基后要贴上标签，写清培养基类型、组别、配置时间。【消毒与灭菌】消毒是指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。灭菌时指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。1、 加热灭菌：（1）干热灭菌：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的，有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。（2）湿热灭菌，0.1MPa，121，1530min。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧
7、将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀，继续加热。由于水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。（细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内的含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高，160170，时间要长，12h，但干热灭菌温度不能超过180，否则，包裹器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。）在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大原因一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因为蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的水
8、蒸气有潜热存在。高压蒸汽灭菌注意事项（1） 使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽的温度。（2） 当含盐类的液体和含盐的琼脂中大量的盐类泼洒在工作腔体，要立即换水，冲洗腔体，仔细擦干锅盖垫圈上的水滴，否则他们会带来腐蚀和变质。（3） 要检查压力表上的指数为“0 MPa”后才能打开锅盖。（4） 外来物质（金属、液体）不能堵塞通风孔，否则会引起装置故障、起火、短路。2、 过滤除菌：通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由
9、于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。3、 辐射灭菌：（1）放射线辐照灭菌。（2）紫外线灭菌：用紫外灯进行的。波长为200300nm的紫外线都具有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强；在波长一定的条件下，紫外线杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理因为紫外线诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制；另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2氧化生成臭氧或使水氧化生成过氧化氢。臭氧和过氧化氢都具有杀菌作用。紫外线灭菌注意事项紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌，紫外线灯距照射物以不超过1.2m
10、为宜；为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前，可在无菌室内喷洒3%5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌；无菌室的桌面、凳子可用2%3%的来苏尔擦洗，然后再打开紫外灯照射即可增强杀菌效果。【消毒与灭菌的注意事项】1、 灭菌的试管培养基冷至50左右再搁置，以防斜面上冷凝水太多。2、 斜面长度不超过试管总长的一半。3、 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。【思考题】1、 培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是否为无菌？答：（1）如果不立即灭菌会使杂菌在培养基上生长，污染培养基。一旦细菌污染了培养基，由于
11、培养基有丰富的营养物质，细菌会在短时间内大量产生，这样就会消耗掉一部分营养物质；另一方面，杂菌生长过程中会产生有毒物质，影响后续培养物的生长。（2）将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。2、 如果要配制一种含有某抗生素的固体培养基，其中抗生素的终质量浓度（或工作浓度）为50微克/mL，你将如何操作？（提示：抗生素在高温下易失效）答：（1）配制成高浓度的抗生素储备液，按比例换算后再加入（2）分别灭菌，抗生素用过滤除菌法灭菌，其他固体培养基成分用高压蒸汽灭菌法灭菌，使用时再混合。实验三 细菌的简单染色【简单染色】简单染色指利用单一染料对菌体进行染色。染料是一类苯环上带有
12、发色基团和助色基团的有机化合物，前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料（酸性复红、伊红、刚果红）和碱性染料（美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿）。【微生物染色原理】在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色；细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。【简单染色步骤】涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥、镜检。1、 涂片：取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水；用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔；用挑取的菌苔沾入载玻片中央生理
13、盐水中混匀并涂成薄膜。注意事项载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水或取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不易过厚。2、 干燥：将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥，也可用吹风机低温吹干。3、 固定：将已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过23次。固定原理加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。注意事项热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。4、 染色：将热固定的细菌涂片平放于载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色时间吕氏碱性美兰12min；石炭酸复红1min；草酸铵结晶紫1min。5、 水洗：手持细菌染色涂片，置于废液缸
14、上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。注意事项水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下；水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。6、 干燥：（1）自然干燥：平放于室温，自然干燥；（2）吹干：用电吹风冷风或低温热风；（3）吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂面两面水分吸干。7、 镜检。注意事项涂片干后镜检（防止水的折射，以便于观察）。【油镜观察步骤】1、 下降载物台，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。2、 在标本镜检部位滴上一滴香柏油。3、 从侧面注视，慢慢转动粗调螺旋，小心上升载物台，使油镜浸入油中，并几乎与标本接触时为止（注意切勿压到标本，以免压碎玻片
15、，甚至损坏油镜镜头）。4、 调节聚光器及照明后，眼看目镜，微微转动粗调螺旋，当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。5、 使用完毕后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。【油镜工作原理】1、 增加照明亮度：香柏油的折射率与玻璃相仿，可以减少通过光线的损失（使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系；如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系）。2、 增加显微镜的分辨率：香柏油的折射率大于空气和水，使油镜的数值孔径值高于低倍镜和高倍镜，分辨能力增强（分辨率是指显微镜能辨别物体两点间的最小距离的能力，能辨别两点间最小距离=/2NA，=光波波长；数值孔径是光线投射到物镜上的最大角度的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，NA=nsin(/2)，n=介质折射率，=最大入射角，即镜口角）。【油镜观察注意事项】1、 高倍镜下找到样品后再用油镜观察；2、 滴加香柏油后，先从侧面注视，调节粗准焦螺旋将镜筒小心下降，不要因下降镜头时用力过猛或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片，下降至几乎与标本接触时为止，注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜镜头；使用完毕后，要用擦镜
