《菟丝子体外和在体实验中对黑素代谢的作用评价》由会员分享，可在线阅读，更多相关《菟丝子体外和在体实验中对黑素代谢的作用评价（120页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、南方医科大学2 0 1 1 级博士学位论文 菟丝子体外和在体实验中对黑素代谢的作用评价 A s s e s s m e n t0 I 【一量给C 以Z 拓( 流“ l P 刀S Z Ss e e n S 7 e 1t t e C t0 n J J 1 n m e l a n o g e n e S l Si nv i t r oa n f li n lW V D 1 课题来源：国家自然科学基金编号8 1 3 7 3 6 4 0 学位申请人 导师姓 名 专业名称 培养类型 培养层次 所在学院 王天晶 杨柳教授 中西医结合临床 学术型 博士研究生 中医药学院 答辩委员会主席范瑞强教授 答辩委员会委
2、员罗深秋教授 许能贵教授 吕志平教授 贾钰华教授 2 0 1 4 年0 4 月1 6 日广州 博士学位论文 菟丝子体外和在体实验中对黑素代谢的作 用评价 博士研究生：王天晶 指导教师：杨柳教授 摘要 研究背景 色素障碍性皮肤病( 如白癜风、黄褐斑) 是临床中常见的皮肤疾病，其对 形象的损毁给患者带来巨大的心理压力，自古以来一直受到医界的重视，而在 亚洲，普通人群对于皮肤美白等美容方面的要求也越来越高，从自然界寻找安 全有效的美白剂早已是化妆品界的研究热点。随着分子生物学技术的迅速发展 及不同模型的出现，黑素代谢的相关研究取得了极大的进步，中医药在黑素代 谢中的作用也积累了丰富的研究成果。然而，
3、由于所选模型不一致，或者药物 提取方法不同，部分中医药对黑素代谢的作用时而出现不一致的结果，究其机 制却鲜有深入的探讨。 本课题在结合古代和现代中医药对黑素代谢作用的基础上，选用菟丝子为 实验药物。早在神农本草经中菟丝子就被记载有“汁去面皮干”的作用， “庋于即黑斑、黧黑斑的意思。菟丝子的功能主治国家标准首次收载于1 9 6 3 年 版中国药典，记载为：补肝肾，益精，明目。主治腰膝疫痛，遗精，目 暗，尿频余沥。未提及菟丝子的外用功效，自1 9 8 5 年修订版开始，历经各次修 订，各版均增加了“外治白癜风“ 的主治标准，2 0 1 0 年版则修订为“外用消风 祛斑外治白癜风”，但功效表述为“滋
4、补肝肾，固精缩尿，安胎，明目，止 泻”，未能为外治功效提供理论依据。文献检索提示，国外的实验研究认为菟 中文摘要 丝子能抑制黑色素合成，可用于增色性皮肤病的治疗，未见菟丝子促进黑色素 合成的报道；与之相对应的，近现代以来，国内对菟丝子治疗增色性皮肤病的 研究较少，其应用于内服方或外治白癜风则更为常见。根据文献，在促进黑色 素合成和抑制黑色素合成的研究中菟丝子均被认为发挥调节作用，但菟丝子的 作用机理尚无进一步的揭示。菟丝子是否具有双向调节黑素代谢的作用? 其调 节机制如何? 作为色素障碍性皮肤病临床治疗中应用广泛而且有效的一味中 药，菟丝子常用于治疗表现完全相反的两类色素障碍性皮肤病，但其发挥
5、作用 的机制并不明确，这给临床用药带来了一定的混乱，我们认为对菟丝子的作用 机制进一步深入研究具有非常重要的现实意义。 色素代谢的研究模型可以分为三类：非细胞模型测试系统，细胞模型测试 系统，动物模型测试系统。蘑菇酪氨酸酶是研究受试药物对酶抑制机理最常用 的非细胞测试模型，酶法测试的优点是无需细胞培养、简单快速，可对受试物 的作用类型进行初步的判断，缺点是体系过于简单，单凭受试物对酪氨酸酶活 性的抑制程度判定其作用效果显得片面；细胞测试系统可反应不同受体基因表 达的变化，一定程度上弥补了蘑菇酪氨酸酶的缺陷。最常用的细胞是小鼠B 1 6 黑色素瘤细胞，其基因组成与人表皮黑素细胞有较高的相似性，较
6、后者相比更 容易获取、培养，是用于测试受试物对黑素细胞生物学功能影响的首选模型之 一。动物测试系统主要包括C 5 7 小鼠、无毛小鼠、豚鼠、S m y t hl i n e 鸡等。斑 马鱼作为国际标准化组织认可的5 种鱼类模式生物之一，具有与人类相似的黑 色素细胞和黑素体，近年来也越来越多的被用于黑素代谢研究领域。又因周身 透明，色素细胞在个体发育过程中易被识别、观察，在黑素细胞遗传学、色素 代谢相关模型构建、高通量药物筛选中均已得到大量的应用；此外，斑马鱼属 低温低氧鱼，其耐寒性和耐热性都很强，饲养容易，产卵量大，与前几种动物 模型相比有特有的优势，在黑素细胞相关研究中将有不可替代的地位。虽
7、然斑 马鱼在中医药对血管系统、中药毒理学研究中已有所应用，但作为黑素代谢研 究的优势模型，斑马鱼在中医药对黑色素合成中的作用研究尚未有报道。 I I 博士学位论文 本研究的目的 明确菟丝子对黑素代谢中的调节作用及机制；探索斑马鱼模型在中医药黑 素代谢实验中的应用。 本研究的实验内容及结果 菟丝子临床使用的剂型主要为水煎剂或酊剂，根据这一用药传统，本课题 分别用水、9 5 乙醇对其回流提取制成了菟丝子水提物( W S C ) 、菟丝子醇 提物( E F S C ) 。选用蘑菇酪氨酸酶、B 1 6 黑素瘤细胞酪氨酸酶提取液、B 1 6 黑素瘤 细胞、斑马鱼胚胎作为模型，通过体外实验和在体实验两种方
8、式，系统研究菟 丝子对黑素细胞色素代谢的作用机制，并借助高效液相色谱法分析W F S C 、 E F S C 成分的差异。 1 在体外实验，本论文首先以蘑菇酪氨酸酶为研究对象，探讨菟丝子提取 物W F S C 、E F S C 对蘑菇酪氨酸酶活性的作用机理；以粗制的B 1 6 黑素瘤细胞酪 氨酸酶为研究对象，比较菟丝子不同提取物对这两种酪氨酸酶活性的作用。再 将W F S C 、E F S C 与B 1 6 黑素瘤细胞共同孵育，研究其对细胞增殖、酪氨酸酶活 性、黑色素合成以及对酪氨酸酶m R N A 、蛋白表达的影响，相关研究内容及结 果详述如下： 1 ) 分别比较了W F S C 、E F
9、S C 对蘑菇酪氨酸酶活性的作用。研究结果表明 W F S C 对蘑菇酪氨酸酶具有抑制作用，E F S C 对蘑菇酪氨酸酶则有激活作用。对 W F S C ，E F S C 的作用机理研究显示，二者与蘑菇酪氨酸酶的结合均为可逆性， 通过酶动力学实验测试，W F S C 对蘑菇酪氨酸酶的活性的抑制作用表现为反竞 争型抑制剂，即主要通过与蘑菇酪氨酸酶底物复合物结合发挥作用；与蘑菇酪 氨酸酶相比，W F S C 对B 1 6 黑素瘤细胞酪氨酸酶提取液的抑制效果相一致。与 W F S C 表现出抑制作用不同的是，E F S C 对蘑菇酪氨酸酶、B 1 6 细胞酪氨酸酶提 取液体系中均表现为激活作用。
10、I I I 中文摘要 2 ) 研究W F S C 、E F S C 对B 1 6 黑素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性、黑色 素含量的影响。结果表明浓度为0 5 “ 2 0 m g m L 时，W F S C 、E F S C 对B 1 6 细胞增 殖均无影响。将W F S C 、E F S C 配制成不同浓度与B 1 6 黑素瘤细胞共同孵育4 8 h 后 测定细胞内酪氨酸酶的活性。与I B M X 作用下的空白对照组比较，W F S C 作用下 的B 1 6 瘤细胞T 乇活性有统计学差异( F = 3 1 7 2 6 ，P = 0 0 0 0 ) ，W F S C 对酶活性 表现为抑制作用，当
11、岍S C 5 m g m L 时，差异均有统计学意义妒 5 m g m L 时，差异均 有统计学意义伙0 0 5 ) ， W F S C 中剂量组和高剂量组间差异无统计学意义 饵= 1 0 0 0 ) 。与空白对照组比较，E F S C 对B 1 6 黑素瘤细胞黑素合成表现出激活作 用( F = 1 2 0 7 7 ，P = 0 0 0 2 ) ，在5 1 0 m g m L 时差异均具有统计学意义 ( 尸 0 0 5 ) ；同样，二者对 T 己蛋白合成差异无统计学意义( P O 0 5 ) 。 2 在体实验中，以斑马鱼为模型，以熊果苷、对羟基苯甲醚( M Q ) 为阳性对 照，观察W F S
12、 C 、E F S C 对斑马鱼黑素细胞的作用，并通过P T U 干预，初步探究 菟丝子对斑马鱼黑素细胞发挥作用的机制；检测各受试物对斑马鱼黑素细胞酪 氨酸酶活性、黑色素合成的影响，相关研究结果如下： I V 博士学位论文 1 ) 0 1 m g m L - - - 2 m g m L I 拘I W F S C 、E F S C 对斑马鱼胚胎生存率没有影响；药 物浓度 3 m 鲈n L 可延迟斑马鱼胚胎的发育，且随着药物浓度的增高，其生成率 降低。经观察发现，W F S C 、E F S C 均不影响斑马鱼黑素细胞的迁移和分布。较 高浓度W F S C 作用下可见斑马鱼黑素细胞呈点状改变，与对
13、照药M Q 的表现相 同，这一现象在加药后6 h I I 可观察到，另一阳性对照药熊果苷也可以使斑马鱼 黑素细胞出现同样的改变，但于加药后约2 0 h 方出现变化，较W F S C 出现形态学 改变的时间晚；E F S C 对斑马鱼胚胎黑素细胞则没有明显的改变。P T U 是酪氨酸 酶阻滞剂，在P T U 干预下，W F S C 、M Q 对黑素细胞的作用消失，但熊果苷仍可 使黑素细胞形态发生改变，这一作用差异可能因W F S C 、熊果苷对酪氨酸酶的 抑制作用方式不一样有关。 2 ) 提取斑马鱼胚胎蛋白后测定酪氨酸酶活性，W F S C 作用下斑马鱼黑素细 胞T 己活性差异有统计学意义( F
14、 = 1 3 0 0 6 ，P = 0 0 0 0 ) 。与空白对照组相比较， W F S C 浓度为l m g m L - - 3 m g m L 时对斑马鱼黑素细胞酪氨酸酶表现出抑制作 用，差异均有统计学意义( P 0 0 5 ) 。W F S C 、熊果苷、M Q 对酪氨酸酶的作用差异无统计学意义 ( P 0 0 5 ) 。W F S C 作用下，斑马鱼黑素细胞黑色合成作用差异有统计学意义 ( F = 1 6 4 7 4 ，P = O 0 0 0 ) 。与空白对照组相比较，W F S C 浓度为l m g m L 3 m g m L 时对斑马鱼黑素合成表现出抑制作用，差异均有统计学意义(
15、 P O 0 5 ) 。W F S C 为3 m g m L 时，与熊果苷、 M Q 相比，对黑素合成的作用差异均无统计学意义( P 0 0 5 ) 。E F S C 对斑马鱼 黑素细胞酪氨酸酶活性未表现出影响( F = 0 8 3 1 ，P = 0 5 3 5 ) ，不同浓度E F S C 对 斑马鱼胚胎黑素合成形成的差异无统计学意义( F = 0 5 9 6 ，P = 0 6 7 4 ) 。 3 高效液相色谱法对W F S C 、E F S C 的成分分析： V 中文摘要 在实验过程中我们发现，W F S C 在提取初期对酪氨酸酶没有抑制作用，反 而表现出轻微的促进作用，至其提取后1 个月
16、方表现出明显的抑制作用，抑制 效果稳定并维持直至提取后6 个月；而E F S C 自提取后即对酪氨酸酶活性表现出 稳定的激活作用。参考苏薇薇等建立的实验方法，本研究对不同时期W F S C 、 E F S C 进行了高效色谱法分析，相关结果如下： 1 ) W F S C 、E F S C 的H P L C 图谱有明显的差异，W F S C 在提取后2 周内峰6 逐 渐低平直至消失，而其提取1 个月后与6 个月后的H P L C 图差异不大，这与W F S C 药效变化的时间拐点相符合；与W F S C 不同的是，E F S C 的H P L C 图谱随时间变 化差异不大，峰5 是E F S C 的特有峰，菟丝子主要由多酚类化合物组成，其中含 有丰富的黄酮类成分，根据流动相设置条件及出峰时间判断，峰5 可能为黄酮 类化合物。 2 ) W F S C 对斑马鱼黑素细胞黑色素合成有抑制作用，为研究W F S C 在斑马 鱼作用下成分的变
