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1、应用生物分子工程技术对持久性有机 污染物进行生物修复的研究进展 Recent advances in the bioremediation of persistent organic pollutants via biomolecular engineering 赵贤亮 2008-06-11 Abstract 随着生物分子工程的研究进一步深入，通过对微生物和 酶进行基因修饰的方法来实现持久性有机污染物（POPs） 的生物修复已经成为环境保护的一个新的研究领域。两种主 要的分子生物学方法：理性设计(rational design)和定向进化 (directed evolution)，已被用来提高
2、微生物和酶对POPs的降 解能力。 本文介绍了最近运用分子生物工程技术来提高微生物和 酶对三类POPs的生物修复的研究进展与应用。这三类POPs 包括多环芳烃(PAHs)、多氯联苯(PCBs)和杀虫剂。目前， 大多数的研究集中在对降解酶的改造上，包括提高酶的表达 水平、增强酶的活性以及拓宽酶底物利用的范围。 总之，生物分子工程技术的快速发展给环境中难分解的 、有毒的有机污染物的修复带来了诱人的发展前景。 生物分子工程 生物分子工程是科学研究和工业生产中一个 崭新的领域。研究的对象是生物分子及其加工处 理过程,其主要任务是发现和生产新的有价值的生 物分子。最终目标通过改进技术和产生新的生物 分子
3、来改善我们的生活质量以及生存的环境。 POPs v持久性有机污染物(Persistent organic pollutants ， POPs)是一系列在环境中长期残留和长距离迁移、 具有脂溶性和生物蓄积性、对人类和野生动植物有 高毒的含碳化合物。 v人们关注的焦点主要有多环芳烃(PAHs)、多氯联苯 (PCBs)、二恶英(Dioxin)和有机氯农药等高难降解 有机污染物。这些有机污染物由于其低水溶性和高 稳定性及一定程度的挥发性而使其得以进行远程迁 移，从而造成全球性的环境污染；又因其高脂溶性 而使其能沿着食物链富集而影响人类的健康和生存 ，也影响到动植物生态系统。 理性设计(rational
4、 design) and 定向进化 (directed evolution) 理性设计是建立在事先了解降解酶的序列信息 、三维结构乃至动力学特征的基础上，需要借助于x 射线晶体学和生物信息学。关于理性设计用得最多 是定点突变(site-directed mutagenesis)和酶亚基置 换。 定向进化则主要包括DNA 重组(DNA shuffling) 、易错PCR(error-prone PCR)和交错延伸过程 (Staggered extension process)。定向进化的主要 特征是用模拟自然进化的过程中随机地引入突变的 方法筛选具有特殊活性的酶。 多环芳烃(PAHs) v多环芳
5、烃是指两个以上苯环连在一起的化合物, 如萘、蒽等 。多环芳烃由于其毒性、生物蓄积性和半挥发性并能在环 境中持久存在, 而被列入典型持久性有机污染物( POPs) ,但 是它能被细菌和真菌中的某种酶生物降解。在过去的几年 里，几种氧化还原酶，如漆酶、细胞色素P450单(加)氧酶 (CYPs)已经被用来降解多环芳烃。 Eg1.多环芳烃(PAHs)能被细胞色素P450单(加)氧酶(CYPs)氧化成儿茶酚，再 被其他的酶（如儿茶酚加双氧酶）降解成无害的产物或进入微生物的三羧酸 循环被分解。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中的CYP101 被证明对 菲，荧蒽，芘以及苯并芘有较低的活性
6、 。用理性设计的方法来提高其催化 活性，基于CYP101的晶体结构，对该酶的F87和Y96位点进行选择性突变。 用多环芳烃(PAHs)底物筛选的研究表明，突变子Y96A, Y96F, F87A/Y96A和 F87L/Y96F的完全氧化速率相对于野生型来说增加了二到三个数量级。 多氯联苯(polychlorinated biphenyl， PCBs) v多氯联苯(polychlorinated biphenyl，PCB)是许多联苯的含 氯化合物的统称 ,它具有结构稳定、毒性大、残留性和富集 性高、不易降解等特点。20世纪30年代开始，多氯联苯应用 广泛，包括杀虫剂的添加剂到变压器的绝缘材料。从上
7、世纪 80年代中期开始，由于它的毒性以及对人和动物的副作用， 各国陆续停止生产多氯联苯。但是由于它难以被降解，至今 依然广泛存在于全球环境中。 Eg2. PCBs 能通过微生物的间位开裂途径降解，它经过三羧酸循环 的中间产物将PCBs氧化为氯苯甲酸(CBA)。降解PCBs的第一步是 通过联苯加双氧酶氧化PCBs。在这步中，酶的催化引入两个羟基 到PCB苯环上，提高PCBs的活性，使它更容易被酶裂解。联苯双 加氧酶由一个大的亚基和亚基组成 。Bariault等(2002)应用DNA 改组技术重组bphA基因，得到的杂交体II-9对极难降解的2，6-二氯 联苯具有很强降解能力(18h降解了58)，
8、而II-9的3个亲本降解能 力都少于10 杀虫剂-阿特拉津 v阿特拉津(atrazine，2-氯-4乙胺基-6-异丙胺基1，3 ，5-三嗪)是一类三嗪除草剂，又名莠去津是一种 选择内吸传导型苗前、苗后除草剂，可防除一年生 禾本杂草和阔叶杂草对某些多年生杂草也有一定 的抑制作用。 Eg3.随着多种降解阿特拉津的微生物的分离，假单胞菌ADP菌（ Pseudomonas sp. ADP）研究得最多，以阐明其负责阿特拉津新陈代谢 的基因和酶。在阿特拉津的生物降解中，假单胞菌ADP菌利用AtzA, B 和C酶转化阿特拉津为氰尿酸。Raillard 等人应用基因改组定向进化TriA 和AtzA基因。两个亲
9、本的酶以及用15种三嗪化合物来筛选1600个突变 子 ，有些突变酶的转化效率提高了150多倍，且增加了其底物结合能力 ，扩大酶的底物谱，但是降解效率没有很大的提高。他们的这项研究证 明了通过定向进化技术提高TriA酶与AtzA酶降解能力具有较大的应用前 景。 杀虫剂-有机磷酸酯 v有机磷酸酯是高度毒性的神经毒素，主要应用于杀 虫剂和化学战的毒性化学品。有机磷酸酯主要包括 ，对氧磷、对硫磷、毒死蜱、乙拌磷、育畜磷、三 硫磷，二嗪农，其中以磷酸酷和硫代磷酸醋类较多 。 Eg4. 细菌对硫磷水解酶（PTE）是一种常见的有机磷水解酶(OPH) ，它是一种高效的水解多种有机磷的水解酶。PTE催化有机磷酸
10、酯 中PO,PF 或 PS 键的断裂。 Chen-Goodspeed 等人用定点突变 的方法对PTE的大小亚基进行置换，用一系列有机磷酸酯检测突变 子的定向性。其结果表明，小亚基的改变增大了酶的活性，但对底 物的特异性没有影响。 展望 v生物分子工程能有效的应用于提高酶或微生物在生物降解系 统中的催化能力。但它自身也有几点限制。 v1.改造一种具有新功能的酶必须克服生物分子工程的难点， 即了解蛋白质的结构、功能、折叠、机制和动力特性，这样 就可用理性设计来解决这些问题。 v2.在原位修复污染环境时，有些基因工程微生物（GEMs） 并不像人们所预期的那样自动的消亡，而是进化和迅速增殖 。基因水平
11、转移(horizontal gene transfer)是自然界中特别是 种群相近的微生物中非常普遍的现象。工程菌基因水平转移 的一个重要问题是抗性基因的传播。 结论 v生物修复相比物理或化学的修复方法具有明显的优 势，因为它成本低廉有效，而且能完全降解有机污 染物而不毁坏污染区域的原貌及其动植物系统。但 是，通过自然进行过程使污染地点的微生物获得降 解能力，例如随机突变发生的机率很小，特别是当 多种降解特性需要的时候，因为污染地点的有机污 染物不仅仅只有一种。所以说，通过生物分子工程 技术加速微生物的进化过程来提高生物修复策略的 方法非常具有前景。 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview
