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1、上海交通大学硕士研究生学位论文体内研究IL-2基因瘤苗抗肿瘤效应及安全性检测The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OF IL-2 GENE VACCINE IN VIVO海 研究生姓名：张某某医学院附属瑞金医院普外科指导老师：赵老师学科（专业）：外科学（普通外科学）培养单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院攻读学位：硕士学位答辩时间：2008年5月上海交通大学学位论文原创性申明本人郑重申明:所成交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本
2、文的研究做出重要的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关的数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 （ ）， 在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于 不保密（ ）。（请在以上括号内打“”学位论文作者签名： 指导教师签名：日期： 年 月 日 日期：
3、 年 月 日目录中文摘要1英文摘要3引言61 试验材料91.1细胞株91.2细胞培养91.3杂交试验91.4动物模型91.5免疫组化92 试验方法102.1细胞培养102.2大肠癌基因瘤苗生物活性的鉴定102.3瘤苗安全性的检测102.4体内实验检测基因瘤苗的抗肿瘤效应。113 结果133.1ELISA检测IL-2蛋白水平得表达133.2瘤苗细胞的安全性检测结果133.3体内实验研究瘤苗的抗肿瘤效应154 讨 论205 结论24参考文献25综述26致谢32发表论文情况33中文摘要体内研究IL-2基因瘤苗抗肿瘤效应及其安全性检测摘 要目的:本课题研究转导白细胞介素-2（IL-2）基因的人大肠癌细
4、胞瘤苗的抗肿瘤效应及其安全性检测。方法：结肠癌细胞株COLO205采用脂质体法稳定转染IL-2基因， 应用ELISA法检测瘤苗的IL-2的表达，筛选高表达IL-2基因的细胞克隆作为基因瘤苗。将已构造好的结肠癌裸鼠模型分为两组，采用瘤体内注射的方法，注射经60Gy60Co照射的瘤苗细胞（治疗组）和PBS缓冲液（对照组）,密切观察肿瘤生长状况，五周后处死所有裸鼠，取出肿瘤，观察并称重，免疫组化法检测IL-2 基因的表达。把已制备好的大肠癌基因瘤苗用60Co进行照射，将照射瘤苗细胞继续培养，用苔盼蓝染色法测定细胞的存活率，将照射的瘤苗细胞和未照射组的瘤苗进行荷瘤试验。结果: 获得基因瘤苗最高表达为C
5、OLO205-H5量为139.13 ng/1107/24h。瘤体内注射瘤苗组的裸鼠肿瘤生长缓慢，较早达到平台期，而对照组的肿瘤生长迅速，差异有显著性。（ t=2.7,p0.05）治疗组肿块的重量也明显小于对照组（t=7.2，p0.01）。移植瘤治疗组IL-2免疫组化结果显示阳性，而对照组为阴性,说明了瘤苗在移植瘤体内存活并分泌IL-2。照射60Gy60Co瘤苗细胞培养在25天内全部死亡，荷瘤试验显示照射后的瘤苗未能成瘤，而未经照射组均已成瘤。结论:通过体内实验研究证实了IL-2基因转导结肠癌细胞制备的瘤苗具有一定的抗肿瘤效应，经60Gy60Co照射后能消除其致瘤性，为肿瘤的治疗提供了一定的实验
6、基础。关键词:大肠癌,白细胞介素-2,基因瘤苗，移植瘤 英文摘要The study about ANTI-TUMOR EFFECT AND SAFETY OF IL-2 GENE VACCINE IN VIVOABSTRACTObjective: To investigate the anti-tumor effect of IL-2 gene vaccine and detect its safety. Methods: Eukaryotic expression vectors containing human IL-2 gene was stably transfected into c
7、olorectal cancer cell line colo205 by lipofectamine. The clones stably overexpression IL-2 gene were identified by ELISA detection, the clones of highly stably overexpressiong of IL-2 were obtained and used for subsequent test. The athymic nude mice carrying the human colon cancer were subdivided in
8、to two groups: treatment groups and placebo groups. The cell clones containing IL-2 gene were irradiated by 60Co(60Gy) and used as treatment group, the phosphate-buffered saline (PBS) administration was used for the placebo group. After 5 weeks, killing all mice , unloading the tumor lump and determ
9、ining its weight, detecting IL-2 gene expression by using immunohistochemical staining. Proliferative viability of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co (60Gy) was tested by typan exclusion assay in vitro, tumorgenesis capacity of IL-2 gene vaccine irradiated by 60Co(60Gy) was tested in xenograft tum
10、or models in athymic nude mice in vivo. Result: We obtained clones of highly expressing IL-2 gene in colon cancer cell line colo205, and the secretion level of cell clones of highly expressing IL-2 gene was 139.13ng/1107/24h. The nude mice in treatment group show the slower tumor growth and smaller
11、tumor weight compared with those in placebo group(t=2.7,p0.05；t=7.2，p0.01). Immunohistochemical staining shows IL-2 gene overexpression in mice of treatment group while little expression of IL-2 gene in placebo group. The IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co(60Gy) shows lower proliferative viab
12、ility and detach the culture plate after 25 days by using typan exclusion method in vitro, the IL-2 gene cell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) have little tumorgenesis capacity in nude mice in vivo. Conclusion: We studied anti-tumor effect of colon cancer cell line colo205 transferred IL-2 gene in
13、vivo and its safety detection, our results show the cell vaccine possess some anti-tumor effect and cancer cell vaccine irradiated by 60Co (60Gy) loss its tumorgenesis.KEY WORDS: colorectal cancer, interleukin-2, gene vaccine，xenograft tumor 引言大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈现逐年升高的趋势。目前，大肠癌的治疗方法主要是以手术为主、辅以局部或全
14、身的放化疗，并有了很高的提高，但50%左右的病人仍然死于转移和复发1。近30年来，随着人类对大肠癌的发生、发展的分子机理不断深入的研究，人类对大肠癌在基因水平上已有深入的研究。大肠癌的发生、发展是一个多步骤，多阶段的复杂过程2，其主要是由癌基因的激活和抑癌基因的失活、DNA修饰功能缺失和机体免疫功能低下等引起的3。大肠癌的基因治疗已取得一定的临床实验疗效，并将被人们更加重视，将会为结直肠癌患临床治疗带来新的选择方法,尤其对出现转移的晚期的大肠癌患者带来福音。大肠癌的发生、发展经历了多基因、多步骤的过程，其中与环境、饮食、生活习惯和遗传因素协同作用有重要的关系4 5。大肠癌在发生发展过程中经历一
15、系列的基因突变和（或）缺失，造成其不仅在生物学特征方面不同于正常的细胞，而且在免疫学方面也发生显著变化6。如一些基因突变和异常表达，使肿瘤细胞表面出现新的抗原，一些基因缺失或表达下降，造成某些抗原丢失7，这些改变使得肿瘤与机体免疫系统之间曾出现错综复杂的关系：一方面肿瘤细胞表面存在特异性抗原，机体免疫系统能识别这些抗原并产生一系列免疫应答，最终排斥肿瘤8；另一方面，机体免疫系统受包括肿瘤本身在内的许多因素影响，发生免疫耐受，使肿瘤逃避宿主免疫攻击，得以生长并发生侵袭转移9。基因治疗诞生于上世纪80年代末及90年代初，作为一种新兴的治疗手段已正式进入临床试验，恶性肿瘤是主要的候选疾病10。但肿瘤属复杂基因疾病，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多阶段多步骤的，至今只有部分基因被鉴定，肿瘤发病的分子机制尚未完全清楚。目前主要存在的障碍有如何选择有效的靶
