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1、白花蛇舌草水提物抗白血病CEM细胞的增殖作用及机制 作者：陈秀珍，朱大诚，王艳辉，欧阳永伟，尹小明【摘要】 目的观察白花蛇舌草水提物对CEM细胞增殖影响及其机制。方法对CEM细胞进行细胞培养。采用台盼蓝拒染法，镜下计数活细胞数，绘制生长曲线，检测白花蛇舌草水提物对CEM细胞的生长抑制作用;琼脂糖凝胶电泳法检测白花蛇舌草水提物对CEM细胞的诱导凋亡作用。结果白花蛇舌草水提物终浓度0.64，3.2，16g/ml均显著抑制CEM细胞的生长，且呈剂量和时间依赖性。琼脂糖凝胶电泳结果显示实验组出现明显的DNA梯形凋亡条带，而空白对照组没有出现梯形条带。结论白花蛇舌草水提物对CEM细胞生长具有显著抑制作用
2、，诱导肿瘤细胞凋亡可能是其主要机制之一。 【关键词】 白花蛇舌草; CEM细胞; 生长抑制; 细胞凋亡Abstract：ObjectiveTo observe the inhibitory function and the mechanisms of the aqueous extract of Hedyotis diffusa Willd on the CEM cells. MethodsCulture the CEM cells. Apply trypan blue exclusion to take count of the live cells in the microscope, p
3、rotract the growth curve and detect the growth inhibitory function of aqueous extract of Hedyotis diffusa Willd on CEM cells. Agarose gel electrophoresis was used to detect the induced apoptosis effects of Hedyotis diffusa Willd aqueous extract on CEM cells.ResultsThe aqueous extract of Hedyotis dif
4、fusa Willd inhibited the growth of CEM cells obviously as the medicine concentration were 0.64g/ml, 3.2g/ml or 16g/ml. The aqueous extract of Hedyotis diffusa Willd could induce apoptosis of CEM cells in dose and time-dependent manner. An obvious apoptotic DNA ladder appeared in the experimental gro
5、up within the agarose gel electrophoresis, while in the control group was on contrary.ConclusionThe aqueous extract of Hedyotis diffusa Willd can inhibit the growth of CEM cell strongly. To induce apoptosis is one of its mechanisms.Key words：Hedyotis diffusa Willd; CEM cell; Growth inhibition; Apopt
6、osis白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd为茜草科一年生草本植物白花蛇舌草的全草，其味微苦、微甘，性凉，入心、肝、肺经，具有清热、解毒、利湿、抗癌等功效。近年来许多学者对白花蛇舌草进行了广泛的研究，特别是其抗肿瘤作用的报道较多，但其对白血病作用的研究较少1，2。本实验研究白花蛇舌草水提物对白血病CEM细胞增殖影响，探讨其抗白血病的机制，为拓宽其在临床上的应用提供实验依据。1 材料和方法1.1 药品及试剂白花蛇舌草由江西药都樟树中药饮片有限公司生产，批号：20080701。白花蛇舌草水提物的提取方法参照陈秀珍等3报道的方法进行，最终配成浓度为220 mg/ml的白花蛇舌草水提
7、物备用。RPMI1640为Gibco公司产品，小牛血清(FBS)为杭州四季清生产，DNA Ladder检测试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司。1.2 细胞培养白血病CEM细胞株本实验室保存。培养基为含体积分数为10%的FBS的RPMI1640，并加入双抗(青霉素100 U/ml和链霉素100 g/ml)。在37，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。1.3 绘制细胞生长曲线取对数生长期的CEM细胞制成细胞悬液，调整细胞数为5104/ml进行实验，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔190 l，实验组分别加入3种不同浓度的白花蛇舌草水提物(每孔终浓度分别为0.64，3.2，
8、16 g/ml)10 l，对照组不加药，只加含血清的RPMI1640培养基10 l，每组3个复孔，每隔24h随机抽取各实验组及对照组3个孔的细胞，按台盼蓝拒染法染色，光镜下计数活细胞数，取平均值，以时间为横坐标，每毫升活细胞数为纵坐标绘制生长曲线。1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳取对数生长期的CEM细胞制成细胞悬液，调整细胞数为3105/ml进行实验，将细胞悬液接种于培养皿，每个培养皿5 ml细胞悬液，即细胞数为1.5106。24 h后，实验组分别加入3种不同浓度的白花蛇舌草水提物(每孔终浓度分别为0.64，3.2，16 g/ml)0.5 ml，对照组不加药，只加含血清的RPMI1640培养基0.
9、5 ml，作用48，72 h后，进行DNA提取，提取方法依照DNA Ladder检测试剂盒的操作步骤进行。取上述提取的DNA样品10 l，加入2 l Loading Buffer,在1.5%琼脂糖凝胶上电泳(凝胶和电泳缓冲液TBE均加入0.5 g/ml的溴化乙啶)，40 V，电泳40 min，紫外灯下观察，用凝胶图像分析仪摄像并分析结果。2 结果2.1 白花蛇舌草水提液对白血病CEM细胞生长的影响 由图1可知，对照组CEM细胞倍增时间为30 h，4872 h进入对数生长期，随后进入平台期。用不同白花蛇舌草水提物终浓度(0.64，3.2，16 g/ml) 的药物处理CEM细胞时，细胞生长受到显著
10、抑制，并呈时间和剂量依赖性。药物浓度为0.64 g/ml时，24 h前细胞数略有增加，随之细胞数逐渐减少;药物浓度为3.2，16 g/ml时，细胞数随时间延长，出现进行性减少。这与我们以前报道的MTT实验结果具有一致性3。图1 不同浓度白花蛇舌草水提物作用于CEM细胞的生长曲线2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡细胞凋亡时基因组DNA被特异性核酸内切酶水解成180 bp及其倍数的片段，经DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯状条带。0.64，3.2，16 g/ml剂量的白花蛇舌草水提物作用CEM细胞48，72 h后，电泳出现明显DNA梯形凋亡条带;而对照组电泳仅有1条大分子带，说明CEM细胞DN
11、A完整。结果见图23。3 讨论白花蛇舌草成分复杂，药理作用广泛1。白花蛇舌草对肿瘤作用的研究较为深入，但主要局限于实体瘤，如今已有学者研究了白花蛇舌草在体外抗白血病的作用，并已证明白花蛇舌草具有抗白血病CEM3、U9374、K562/ADM5，6、HL-60/ADR7细胞株的增殖作用，其抑制增殖的可能机制与诱导肿瘤细胞凋亡3，4，6，7和抗氧化损伤5有关。本实验结果显示，白花蛇舌草水提物对白血病CEM细胞增殖具有显著的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性，随剂量增大和时间延长，其抑制增殖的能力增强。细胞凋亡是一种不同于细胞坏死，且受多基因调控的主动性自我消亡过程，与肿瘤的发生、发展及退化密切相关，可
12、被多种药物与理化因素诱发。本实验CEM细胞经白花蛇舌草水提物(0.64，3.2，16 g/ml)作用48，72 h后， DNA凝胶电泳可见明显的梯形凋亡条带(DNA ladder)，而对照组未出现，这说明白花蛇舌草抑制CEM细胞增殖的机制是诱导细胞凋亡。本实验研究结果表明白花蛇舌草能够显著抑制体外培养的白血病CEM细胞增殖，并能诱导其凋亡，提示白花蛇舌草有可能成为新型天然的抗白血病药物，为白花蛇舌草的临床应用提供了实验基础，其诱导CEM细胞凋亡的分子机制及体内是否有抗白血病活性还有待进一步研究。【参考文献】 1 陈秀珍，朱大诚，王艳辉.白花蛇舌草药理作用及临床应用研究新进展J.中药材，2009
13、，32(1)：157.2 朱大诚，尹小明.白花蛇舌草抗肿瘤作用及其机制研究进展J.江西中医学院学报，2006，18(1)：74.3 陈秀珍，朱大诚，王艳辉，等.白花蛇舌草对白血病CEM细胞的抑制作用及诱导其凋亡的研究J.时珍国医国药，2009，20(10)：2461.4 林圣云，叶宝东，胡美薇，等. 白花蛇舌草提取物诱导U937细胞凋亡的实验研究J.中国现代应用药学杂志，2007，24(2):89.5 石娜娜，虞荣喜. 白花蛇舌草醇提物对白血病K562/ADM细胞增殖的影响J.浙江中西医结合杂志，2008，18(11)：687.6 许明君， 施华球， 苏晓蓉，等. 白花蛇舌草注射液逆转K562/ADM细胞多药耐药的作用和机制J.中成药，2008，30(3)：327.7 尹小明，赵诗云，吴东风，等. 白花蛇舌草提取液诱导多药耐药白血病细胞HL-60/ADR凋亡的研究J.实验与检验医学，2008，26(6):593.
