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1、集美大学 硕士学位论文 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 姓名：周鹏 申请学位级别：硕士 专业：水产养殖 指导教师：王艺磊 2009-06-12 I 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 摘 要 以大黄鱼 （Larimichthys crocea） 性腺为材料， 采用SMART （switching mechanism at 5 end of RNA transcript）技术和 DSN( duplex- specific nuclease）处理构建了大黄鱼性腺线性化 cDNA文库，并从文库中随机挑取了 3961 个克隆进行测序，共获得 3535 条高质量的表达 序列标签（Expres
2、sed Sequence Tag，EST） 。序列经聚类分析后共得到 2916 条 Unigene，包 括 415 条 contigs 和 2501 条 singletons。初步分析结果表明：该线性化文库的库容为 4.3 106pfu/mL， 文库重组率达95.8%， EST的非冗余率为82.49%， Unigene 的平均长度为355 bp。 经生物信息学分析，1785 个为已知基因占总 ESTs 的 61.21%；其中与性腺发育相关的基因 66 个，占已知基因的 3.70%。微卫星分析发现共有 129 条 EST序列含有 149 个微卫星重复 序列，包括 6 条与性腺发育相关的 ESTs
3、。利用实时荧光定量 PCR（qRT- PCR）技术分析了 11 个与性腺发育相关基因在大黄鱼性腺的表达情况。结果显示精巢特异性 LRR 基因 （testis- specific LRR）只在大黄鱼精巢中表达（P6 0 0 *Unigene Size：每个 Unigene 的 ESTs 重复数。 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 2 1 4 5 6 9 9 3 1 1 71 4 11 6 51 8 92 1 32 3 72 6 12 8 53 0 93 3 33 5 73 8 14 0 54 2 94 5 34 8 05 0 46 6 9 O R F 长度( b p )
4、 E S T s 数 1 1 8 7 0 1 5 6 3 3 4 3 9 6 6 5 4 5 4 2 3 2 2 9 5 1 6 652 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 1 0 0 1 4 4 1 4 5 1 9 9 2 0 0 2 4 4 2 4 5 2 9 9 3 0 0 3 4 4 3 4 5 3 9 9 4 0 0 4 4 4 4 4 5 4 9 9 5 0 0 5 4 4 5 4 5 5 9 9 6 0 0 6 9 9 7 0 0 7 9 9 8 0 0 E S T s 长度( b p ) E S T s 数 图 2- 6 OR
5、F 长度分布图 图 2- 7 ESTs 长度分布图 集美大学硕士学位论文 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 17 表 2- 5：ESTs 中的微卫星* *No.：微卫星序列在 ESTs 中出现次数。 2.2.4 ESTs 同源分析和注释 经 BLAST程序与 GenBank 中非冗余蛋白数据库对比分析，当 e- value 0.05） 。 图 3- 23 大黄鱼 UBC9 氨基酸序列与其它物种的同源比对 黑体部分为 UBC 保守结构域；灰色部分为 UBC9 基因的激活位点区域。同源性比对所用 GenBank 上已注册的 UBC9 氨基酸序列如下：Larimichthys crocea:
6、FJ195328; Salmo salar: ACI67139; Osmerus mordax: ACO08933; Oncorhynchus mykiss: ACO08653; Danio rerio: NP_571426; Rana catesbeiana: ACO52076; Taeniopygia guttata: ACH44578; Homo sapiens: NP_003336; Mus musculus: NP_035795; Drosophila melanogaster: NP_476978; Nematostella vectensis: XP_001640489; Spe
7、rmophilus tridecemlineatus: ABD39323。 S. salar O. mykiss O. mordax L.crocea D. rerio R. catesbeiana H. sapiens M. musculus D. melanogaster N. vectensis S. cerevisiae 70 79 64 97 100 85 55 87 图 3- 24 UBC9 系统进化树 集美大学硕士学位论文 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 62 3. 3.10 讨论 3.3.10.1 Cyp19a 和 cyp19b 基因 芳香化酶是类固醇激素代谢中的一种重
8、要酶类，属于细胞色素 P450 家族中的一员， 广泛存在于脊椎动物的脑和性腺中，可以催化雄性激素转化为雌性激素，是雌激素生物合 成中的关键酶和限速酶136。 研究表明，芳香化酶可以影响哺乳动物中枢神经系统的功能和 发育，调节神经内分泌和繁殖功能及性行为137，并参与哺乳动物性腺分化的调控138。在 人类芳香化酶 P450 只由一种形式的 cyp19 基因编码136。与大多数哺乳动物不同，在硬骨 鱼类， 芳香化酶 P450arom至少由 2 种 cyp19 基因编码， 即脑芳香化酶 P450arom B （cyp19b） 和性腺芳香化酶 P450arom A（cyp19a），它们以不同的形式分别
9、存在于脑和性腺中139。 金鱼由一个基因编码脑芳香化酶，而斑马鱼由两个基因编码性腺芳香化酶139；虹鳟中则发 现有两种类型的 P450arom B，可能由一个或两个基因编码140。 本研究发现，大黄鱼在多种器官中都存在芳香化酶的两种表达形式，一种1805 bp，另 一种2268 bp，分别编码518和500个氨基酸，两种芳香化酶氨基酸序列的相似性为63%。同 源性比较分析发现，大黄鱼芳香化酶基因cyp19a和cyp19b与斑马鱼、金鱼、石斑鱼和鲷科 鱼类的同源性分别都高达65%以上。表明芳香化酶基因在进化上保守性较高。 本文使用实时荧光定量PCR研究了大黄鱼cyp19a和cyp19b在各器官的
10、表达，结果发现， cyp19a和cyp19b基因在性腺、肝脏、脾脏、肌肉和脑等器官均有表达，分布较广泛。cyp19b 在脑中的表达量高于性腺，而cyp19a在性腺中的表达量高于脑，这与斑马鱼、金鱼和石斑 鱼的研究结果相似139, 141, 142。对cyp19a基因和cyp19b基因在各器官的表达，在不同鱼使用 不用的方法进行了研究，但结果不尽相同。如Tchoudakova143等使用半定量RT- PCR对金鱼 cyp19b基因在各器官的表达研究，表明该基因只在脑中表达，在卵巢中没有检测到表达。 Kishida11等使用Northern杂交对斑马鱼cyp19b的表达研究发现除了在脑中表达外，在
11、卵巢 图 3- 25 大黄鱼 UBC9 基因在各器官的表达情况 a 与 b，b 与 c：存在极显著差异（P0.01）。a 与 b：存在显著差异（P0.05）。 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 精巢卵巢血脑头肾肾肝肌肉脾 器官 R Q a b c c c c c c c 集美大学硕士学位论文 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 63 中也有弱表达，但在肝脏中无表达；而cyp19a除了在卵巢中表达外，在脑和肝脏中均无表 达。Tamala等克隆并分析了cyp19a在雌、雄虹鳟十种器官中的表达，发现cyp19a在脑和肾 脏的表达量几乎相等，而
12、在鳃、性腺等器官表达很弱；相反，cyp19b只在脑、性腺和鳃中 表达144。李广丽142等采用半定量RT- PCR研究了赤点石斑鱼cyp19a和cyp19b在性腺和脑等 二十一种器官的表达，结果表明，cyp19b有广泛的器官分布，脑和垂体的表达量很高，各 器官表达量有明显的雌、雄差异；cyp19a表达主要集中于垂体和性腺，且不论雌雄，其性 腺表达量均高于脑。造成各研究结果不同的可能与所研究鱼的种类、年龄以及所处发育状 态有关，也与研究的方法有关。但一致的是cyp19a和cyp19b在脑和性腺的表达存在明显的 器官特异性。 综上所述，大黄鱼多种器官中存在由两个基因编码的芳香化酶，即脑型芳香化酶基
13、因 cyp19b和性腺型芳香化酶基因cyp19a，二者的氨基酸序列均与已报道的鱼类同源性很高。 两种芳香化酶基因具有一定的雌、雄差异表达，cyp19a在卵巢中的表达量极显著高于精巢 （P0.01） ，且cyp19a在精巢和卵巢中的表达均极显著高于其它各器官（P0.01） ；cyp19b 在端脑、中脑、下丘脑、脾和肝有较高表达量，在雄性大黄鱼的血中表达量最高，在性腺 表达量极低。 3.3.10.2 Cyclin B1 和 CDC2 基因 一个完整的细胞周期是指细胞从一次分裂结束起到下一次分裂结束这一过程，分为间 期（G1、S 和 G2 期）与分裂期（M）两个阶段，G1/S 和 G2/M为两个过渡
14、期。在完成有 丝分裂后，有的细胞可退出周期，进入 G0 的静止期。G1 期细胞对环境因素敏感，如果环 境不适，细胞将停滞于 G1 期，如果细胞越过 G1/S 的限制点（restriction point，R 点）， 不顾环境条件就可完成有丝分裂。 在 G2 期，细胞将检测 S 期 DNA复制的完成与否或有无 错误发生。G2/M 转换中的检查点（check point）将检测 DNA复制的准确性。细胞周期是 生命增殖的重要过程，其有条不紊的进行依赖于 cyclins- 细胞周期蛋白依赖性激酶（ CDKs） - 细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白为中心的细胞周期的精密调控68。 细胞周期蛋白通常 分
15、为 G1 期和 M 期细胞周期蛋白。前者包括细胞周期蛋白 C、D 和 E 等，主要是启动细胞 周期和促进 DNA合成；后者包括细胞周期 A 和细胞周期 B，主要功能是诱导细胞分裂。 与其它物种一样，大黄鱼 cyclin B1 的氨基酸序列含有一保守的周期蛋白框，借此与 CDC2 激酶结合；近 N 端还含有一段 RxALGxIxN 序列的破坏框，参与泛素介导的降解。 CDK1（又名为 P34cdc2）是 CDC2 基因编码的 34KD 的蛋白质，其 N 末端第 14 个氨基酸残 基苏氨酸 （Thr14） 、 第 15 个氨基酸残基酪氨酸 （Thr15） 和第 161 个氨基酸残基苏氨酸 （Thr
16、161） 对其活性的影响至关重要145。生理调控 CDC2 活性，就是调节其磷酸化与脱磷酸化146。 1971 年，Masui和 Markert147报道，将孕酮诱导成熟的豹蛙（Rana pipiens）卵母细胞 的细胞质注射到停滞在减数分裂第一次分裂前期的卵母细胞，可引起生发泡破裂从而完成 第一次减数分裂；随即进行第二次减数分裂，并停留在分裂中期，成为成熟的卵母细胞等 集美大学硕士学位论文 若干大黄鱼性腺发育相关基因的克隆与表达 64 待受精。Masui 和 Markert 把成熟蛙卵中能促进卵母细胞成熟分裂的成分称为 MPF147。现 已研究表明，熟促进因子 MPF 是由 cyclin B1 通过与 CDC2 结合形成的具有蛋白激酶活性 的异源二聚体复合物，cyclin B1 为调节亚基，CDC2 为催化亚基，参与磷酸化多种蛋白调 节与 DNA复制
