《王浆蛋白酶解技术和accmrjp5基因重组表达及产物活性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《王浆蛋白酶解技术和accmrjp5基因重组表达及产物活性研究（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、论文评阅人1 ： 奎经一教援 评阅人2 ： 韭笾淫教援 评阅人3 ： 王垩至 一。副熬援 答辩委员会主席： 重量盛数援 委员1 ： 奎经教援 委员2 ： ：遏凰茎麴援 委员3 ： 沈童苤塾援 委员4 ： 塞加进副教援 A u t h o r ss i g n a t u r e ： 一 b u p e r v i s o r 7Ss i g n a t u r e ： E x t e m a lR e v i e w e r s ： L iD u o E x a m i n i n gC o m m i t t e eC h a i r p e r s o n ： 丛呈里g 至鱼叟殳h 星旦g
2、 E x a m i n i n gC o m m i t t e eM e m b e r s ： 一 L iD u o D a t eo fo r a l d e f e n c e ：丛堑西兰! ! ，2 Q ! ! 一 竺煎差蚴差 蚴一 糊艘 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特I I I I 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：
3、私：节先签字目期；如f f 年弓月争日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘堂：有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权逝江态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者弛私佛劾薪躲懈 签字日期： f ( 年弓月印日签字日期：l fm 弓月g 日 本研究承蒙 国家高科技研究发展计划“8 6 3 力专题资助 ( 项目编号：2 0 0 7 A A l 0 2 3 2 4 ) 浙江大学
4、硕士学位论文 目录 目录 摘 要。I A b s t r a c t I 第一章王浆蛋白及其酶解产物活性肽研究进展2 l - 王浆中蛋白质的种类及生物活性。2 1 1 王浆中蛋白质的种类2 1 2 王浆中蛋白质的生物活性3 2 王浆蛋白酶解物的制备及分离纯化技术4 2 1 以鲜王浆或王浆冻干粉为原料的酶解技术j 4 2 2 以单一蛋白为底物的酶解技术5 2 3 酶解产物分离纯化技术5 3 王浆蛋白酶解产物的种类与生物活性5 3 1 抗氧化活性肽研究进展5 3 2 降血压活性肽研究进展7 4 M E 己腰s 在分子水平上的研究进展8 5 毕赤酵母表达系统概况。8 第二章研究目的、意义及技术路线一
5、1 1 1 目的意义：1 1 2 研究内容1 2 3 技术路线( 本研究技术路线如图2 1 所示) 1 3 第三章王浆主蛋白酶解工艺优化及产物活性研究1 5 、 l 材料、试剂和设备1 5 1 1 实验材料。15 1 2 实验试剂：1 5 1 3 实验设备j 1 6 2 实验方法16 2 1 酶解路线16 2 2 蛋白质含量测定16 2 3 水解度测定17 浙江大学硕士学位论文 目录 2 4 王浆蛋白水解产物( H M R J P s ) 的制各。1 8 2 5 王浆蛋白水解产物( H M R J P s ) 的初步分离一1 8 2 6 抗氧化活性测定l8 2 7 血管紧张素转化酶( A C
6、E ) 抑制活性2 0 2 8 数据统计及分析2 0 3 实验结果小2 0 3 1 原料预处理对酶解效果的影响。2 0 3 2 水解条件单因素试验2 l 3 3 胃胰蛋白酶共同作用的正交实验2 5 3 4 酶水解产物S D S - P A G E 电泳检测- 一2 6 3 5 超滤法分离王浆蛋白水解产物中的生物活性肽2 7 3 6 抗氧化活性检测2 8 3 7 血管紧张素转化酶( A C E ) 抑制活性检测：2 9 4 讨论3 0 第四章中华蜜蜂A c c M R J P 5 基因克隆及在毕赤酵母中的表达3 2 1 材料、试剂和设备3 2 一二一1 实验材料及设备- 3 2 。 1 2 工具
7、酶和试剂盒矗3 3 1 3 试剂的配制3 3 2 实验方法3 5 2 1 引物设计及P C R 扩增目的片段o 3 5 2 2 酵母表达载体构建。3 6 2 3 电转化毕赤酵母3 8 2 4 多考贝克隆筛选3 8 2 5 阳性克隆诱导表达3 9 2 6 表达产物W e s t e r nb l o t 分析3 9 3 实验结果“4 0 3 1A e c M I 己印5 基因片段的获得4 0 3 2 酵母表达载体的构建及基因序列鉴定4 1 n 目录 4 ：2 分析4 4 4 5 4 6 4 6 ：4 8 4 8 1 1 实验材料及设备4 8 1 2 试剂的配制_ 4 8 2 实验方法4 9 2
8、1A c c M R J P 5 表达产物的分离纯化4 9 2 2A c c M R J P 5 去糖基化：4 9 2 3 表达产物对家蚕细胞R m 1 7 生长的影响。5 0 3 实验结果- 51 3 1 重组表达A c c M R J P 5 的分离纯化5 1 3 2 表达产物去糖基化5 3 3 3 重组A c c M R J P 5 对家蚕细胞R m 1 7 生长的影响：5 3 4 讨论5 5 结 论5 6 1 本研究主要研究成果及应用前景。5 6 2 主要创新点5 6 3 今后研究方向：5 6 参考文献5 8 致 射6 2 攻读硕士学位期间发表论文情况6 3 l 浙江大学硕士学位论文摘
9、要 摘要 蜂王浆( r o y a lj e l l y ) 是蜜蜂哺育工蜂头部王浆腺分泌的乳状物，是1 3 日龄工蜂幼 虫及蜂王终身所食用的食料，具有抗疲劳、预防肿瘤、免疫调节等多种营养保健功能 和生理活性。蜂王浆的神奇功效与它所含有的活性成分密不可分，其中蛋白质是重要 的营养成分，蛋白质中的可溶性蛋白又称为王浆主蛋白M P J P s ( m a j o rr o y a lj e l l y p r o t e i n s ) ，国内外研究已部分证实M R J P s 可能是蜂王浆中的重要营养及生理调节因 子。 、 本研究首先利用生物酶解技术，通过对p n 、水解时间和酶浓度等酶解工艺条
10、件 的优化，得到王浆蛋白水解的最佳条件：3 7 下王浆水溶性蛋白，先后用1 ( w w ) 的胃蛋白酶在p H - 2 0 和胰蛋白酶在p H = 7 5 的条件下水解4h 。在上述条件下水解得 到王浆蛋白水解产物( H - M R J P s ) 的水解度为2 8 7 ，总氮回收率为3 5 5 。利用超滤 技术对H 卿s 进行初步分离纯化，活性测定发现分子量小于1k D a 的肽组分是 H 1 V I ；U P s 中起抗氧化作用和降压作用的主要物质，其抑制血管紧张素转化酶( A C Z ) 的半抑制浓度( I C s 0 ) 达到O 6 7m gp r o m L 。 其次，本研究构建了p P I C9 K A c c M R J P 5 重组穿梭载体，将p P I C9 K A c c M R J P 5 线性化，电转化到毕赤酵母G S l l 5 ( P i c h i a p a s t o r i sG S l l 5 ) 中。采用添加G 4 1 8 抗生素 。 的培养基，对重组酵母多拷贝表达菌株筛选，得到6 个阳性高表达菌株。对高表达菌 株进行甲醇诱导表达，表达产物S D S P A G E 电泳分析，发现
