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1、南方医科大学博士学位论文耐力运动和高脂膳食大鼠骨骼肌表型适应的分子机制姓名：廖八根申请学位级别：博士专业：内分泌与代谢病指导教师：薛耀明20080416博士学位论文耐力运动和高脂膳食大鼠骨骼肌表型适应的分子机制博士研究生：廖八根指导教师：薛耀明摘要背景骨骼肌由慢缩肌纤维和快缩肌纤维组成。根据肌球蛋白ATP酶染色或和肌球蛋白重链(myosinheavychain，删C)异构体的表达，成年啮齿动物骨骼肌纤维可单纯地分为I型(氧化型慢缩肌)和IIa型(糖氧化型快缩肌)、IIb型(糖酵解型快缩肌)、IIX型(介于IIa与IIb之间)。骨骼肌既是执行运动及调节机体葡萄糖、脂质、蛋白质代谢的重要器官，也是
2、一高度可塑性器官。对不同的代谢功能需求和代谢变化(如运动、营养的改变)，骨骼肌纤维大小和类型可产生相应的适应性改变。人类许多代谢疾病如糖尿病等可出现肌萎缩、肌纤维类型改变，探究影响骨骼肌纤维转换和纤维大小的细胞内信号通路及它们之间的对话可为肌萎缩病理性肥大相关疾病、残疾康复、糖尿病等代谢疾病的治疗及预防开发新药靶位点。运动和膳食是影响骨骼肌表型的重要因素。我们前期的预实验结果显示耐力运动和高脂膳食影响骨骼肌纤维类型和纤维大小。已清楚钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)活化T细胞核因子(NFATc。)是调节骨骼肌纤维转换的重要通路，而AKtS6K1GSK一3是调节骨骼肌大小的重要通路
3、，但两者是否参与了耐力运动和高脂膳食时骨骼肌表型的改变以及两通路间是否存在联系目前并不清楚。本研究拟通过二个在体实验探讨骨骼肌表型转变时CaN信号和AKt信号通路分子的活性变化及其联系。中文摘要第一章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨髂肌表型的交互影响【目的】明确大鼠不同类型骨骼肌在短期耐力运动和高脂膳食后肌纤维表型的适应性变化，为下一步研究提供依据。【方法】40只雄性SD大鼠(重150-1809)单纯随机等分为四组：正常饲养不训练组(J下常组)、高脂饲养不训练组(高脂组)、正常饲养训练组(运动组)、高脂饲养训练组(高脂运动组)。正常膳食热卡(145KJg)配方为：碳水化合物占66，蛋白质占21，脂肪
4、占13；高脂膳食热卡(21KJg)配方：碳水化合物占20，蛋白质占21，脂肪占59(以猪油为主)。运动方式：在坡度为0的电动跑台(有尾电激)进行训练(训练完后立即投食，次日晨8：00移去食物)，速度由20米分递增至28米分，每次运动l小时，每周6次，共6周。实验结束前三天，进行腹腔糖耐量试验(IPGTT)，实验结束时取空腹血用比色法分析空腹血糖(FBS)、甘油三酯(FTG)、游离脂肪酸(FFA)、血浆总氨基酸(FAA)，用放免法测空腹血浆胰岛素(FINS)。取大网膜脂肪、肾周脂肪和睾周脂肪作为腹内脂肪含量称重。取双侧比目鱼肌(SOL)和趾长伸肌(EDL)，右侧肌称重后用删CSDSPAGE电泳法
5、、肌纤维ATPase染色法测定纤维类型和纤维横断面积，用比色法测定琥珀酸脱氢酶(SDH)、B一羟酰辅酶A脱氢酶(HADH)活性。【结果】16周的高脂膳食显著增加大鼠腹内脂肪含量、降低腹腔糖耐量，耐力运动则明显降低高脂膳食诱导的腹内脂肪积聚(高脂膳食组为13566549，高脂运动组为7634-2159，PIIxdIIb。本研究耐力运动后SOL纤维I型比例增加，可能使整个肌肉SDH活性增加有所折扣。至于高脂膳食，研究显示使骨骼肌SDH活性或柠檬酸氧化酶活性增加、不变或降低nm31捌。本研究显示高脂膳食相对于运动组，SOL的SDH活性较低，EDLSDH活性也倾向降低，这表明高脂膳食时骨骼肌线粒体氧化
6、能力降低。HADH是脂肪酸13氧化代谢的限速酶。本研究显示耐力运动和高脂膳食增加EDL的HADH活性，这意味它们增加骨骼肌脂肪氧化能力。此结果与既往研究妇结果一致。结合SDH活性和HADH活性变化，结果表明耐力运动时骨骼肌脂肪酸13氧化能力和线粒体氧化能力同步提高，而高脂膳食时则仅脂肪酸13氧化能力升高，线粒体氧化能力却不升高或降低，两者脱节，这可能是造成骨骼肌IR的重要原因一【54喝】“一O小结16周的高脂膳食显著增加大鼠腹内脂肪含量、降低腹腔糖耐量，耐力运动则明显降低高脂膳食诱导的腹内脂肪积聚、改善高脂膳食损害的腹腔糖耐量。2耐力运动升高趾长伸肌的SDH活性和HADH活性：而高脂膳食降低比
7、目鱼肌的SDH活性，增加趾长伸肌的HADH活性。3高脂膳食升高空腹血浆胰岛素浓度；耐力运动后摄入正常膳食和高脂膳食空腹血浆胰岛素不下降。第章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌表型的交互影响46周的无坡度跑台运动促进尘长期大鼠比霞鱼肌向慢腮纤维转换，高脂膳食倾向抑制耐力运动诱导的比目鱼肌向慢肌纤维转换；但不影响趾长伸肌纤维类型。5耐力运动和高脂膳食增加生长期大鼠比目鱼肌质量，但不影响比目鱼肌纤维横断面积；耐力运动和高脂膳食对趾长伸肌质量有交互影响，且耐力运动增加趾长伸肌Typel纤维横断面积，高脂膳食降低趾长伸胍TypeI、TypeIIb纤维横断面积。6空腹血浆胰岛素浓度与比譬鱼肌质量相关，但与比鼠
8、鱼肌的纤维类型、趾长伸肌质量和纤维类型相关无显著性意义。博士学位论文第二章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌Calcineurin和Akt信号通路影响我们前面的研究显示耐力运动和嵩脂膳食可影响生长期大鼠骨髂肌大小和纤维组成，胆空腹血浆胰岛素与比目鱼肌质量低度相关，但与趾长伸肌的纤维类型鞠质量不相关。融于Akt信号通路和CaNNFATe；信号通路是影响嚣骼矍氇质量和纤维转换的重要途径，耐力运动和高脂膳食引发骨骼肌表型改变是否与这些信号分子有关本研究拟进一步调查。第一节实验材料与方法11实验材料11。l实验动物同第一部分。112主要试剂预染Marker(P7708，Biolab)丽春红(武汉博士德)兔
9、拭CaN(SantaCrtuz，SC-9070)兔抗NFATcl(SC-13033)兔抗卜kt(Ser473)(se一7985-R)羊抗P-S6K1(Thr389)(SC-11759)兔抗GSK一3(Neomarkers)HRP-羊抗兔和HRP-兔抗羊二抗(ZymedLab，AmershamBioscience)ECL试剂盒：BeyoECLGSK底物肽(Lot#26770，UPSTATE)Y-32pATP(中国同位素公司)Calcineurin活性测定试剂盒(CalcineurinAssayKit，Colorimetric，3l第二章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌Calcineurin和hkt
10、信号通路影响CALBIOClEId)胞浆和胞核蛋白提取试剂盒(凯基生物有限公司)113主要仪器设备和耗材PVDF膜(Millpore)CLP垂直电转仪X片(Korda)WhatmanP8I滤纸液闪计数仪其他同实验第一部分12方法121实验动物分组、干预方法及取材：同第一部分羔。2。2胞浆和胞核蛋自提取：按凯基胞浆和胞核蛋白提取试剂盒操作说明，略有改动。取冻存肌肉置入冰生理盐水中，修去可见脂肪、结缔组织，留取约40撩g滤纸吸予称重后敖入含0。3ml缓冲液矗匀浆，旋混振荡15秒，冰上放置10-15分钟，加入缓冲液B165p1，旋混振荡5秒，冰上放置1分钟，再次振荡5秒，随即1600094。C离心5
11、分铮，上清即为胞浆器自。泼淀加入150IC液，旋混振荡15秒，冰上放置40分钟，每10分钟振荡1次，1600094。C离心10分钟，上清郄为核蛋自。用考马斯亮蓝法测胞浆和胞核蛋自，势统一调节成5PgPl(胞浆用A液调，胞核用DH：0调)，分装，一80C保存。王23WesternBlotting(1)取出蛋白质样品加入蛋白质上样缓冲液，混匀，样品和预染Marker95-98煮5-10分钟，各样品等量上样。(2)用75-10的SDS-PAGE电泳(缓冲液为25ramTris，192IllM甘氨酸j0ISDS，不调p拜值)。点样前恒压20V预电泳lO分钟。点样后恒压70V，至滨酚兰前沿进入分离胶后，
12、提高电压至120V继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部。(3)湿式电转移：电泳结束后，于转移缓冲液(25toldTris-C1，192rim甘氨酸，博士学位论文20甲醇，200PMNa3V04)中小心取出凝胶，切与凝胶同样大小的2张3毫米滤纸和一张PVDF膜，在转移缓冲液中浸透，从阳极侧按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序固定在CLP湿式转移电泳槽中，于4C冰箱中以IOOV电转移152h。转移结束后，取出PVDF膜丽春红染色以证实等量E样(图2l；图22)剪下相应各带，于TBST(10训Tris150mMNaCl，005Tween，pH74)中洗涤。田22胞棱SOL和EDL丽春红染色第二章耐力运动和
13、高脂膳食对大鼠骨骼肌Calcineurin和Akt信号通路影响(4)封闭：将转移好的PVDF膜置于40ral含5脱脂牛奶的TBST室温封闭1小时。(5)加入相应一抗(用含5BSA的TBST稀释)4C孵育过夜。一抗分别为兔抗CaN(1：500)、兔抗NFATcl(1：350)、兔抗P-Akt(Ser473)(1：400)、羊抗P-S6K1(Thr389)(1：350)、兔抗GSK-3(1：800)。次日用TBST洗涤3次，每次lOmin。(6)加入相应的HRP结合二抗(1：2000，5BSA的TBST稀释)，室温孵育15h。洗涤同上。(7)ECL法显影：按试剂盒说明书进行。洗涤结束后，将PVDF
14、膜平放在石蜡板上，等量混和ECL试剂盒中的A液和B液，加于膜上以覆盖全膜，室温孵育12min：然后用滤纸吸去多余的ECL试剂，置膜于两层保鲜膜之间，将膜吸附蛋白面朝上，置于X光片暗盒中，于暗室中曝光、显影、定影。数码拍照分析。(8)PVDF膜再次使用：显影完成后PVDF膜用含20SDS、7mllOOmlB一疏基乙醇的625mmolLTris缓冲液(pH67)于70。C水浴振荡30min，洗去结合的抗体，再次以其他抗体为一抗再同上作Western印迹。X片拍照后用ImageJ软件分析。每膜以正常组条带为参照，计算其他各组蛋白条带的相对浓度。124胞浆和胞核CaN活性、GSK活性测定1241胞浆和
15、胞核CaN活性测定：按试剂盒操作进行，略有修改。1标准曲线制定(1)每孔加入50p1浓度分别为2、1、05、025、Onmol标准磷液。(2)加入25pl含calmodulin的反应液。(3)然后加5“lcalcineurin，每孔calcineurin40U。(4)每孑L加入lOgl双蒸水后，置入30C生化箱内。(5)加入lOI-tl075mMRII底物肽启动反应，反应3020分钟。(6)加入100plMalachiteGreenreagent终止反应。(7)30分钟后酶标仪用620nM波长测定。博士学位论文标准曲线结果见图2-3。无15机磷浓度1D置目o。05OJO二m040od值图2-3
16、胞浆和胞核CaN活性测定标准曲线图2样本测定(1)加入25p1含calmodulin的反应液。(2)然后加5mcalcineurin，每孔calcineurin40U。(3)加入lOpl样本(样本测定管)。(4)置入30生化箱内10分钟。(5)加入10pl075mMRII底物肽启动反应，反应3020分钟。(6)加入100“lMalachiteGreenreagent终止反应。(7)30分钟后用酶标仪在620nM波长测定。另外同样的一份样本加入底物肽后随即加入100肛1MalachiteGreenreagent终止反应测定样本固有的无机磷(样本对照管)。样本无机磷释放量为样本测定管减样本对照管。钙调神经磷酸酶活性(nmolminmgprotein)=样本无机磷释放量反应时间X反应体系中样本稀释倍样本蛋白含量。第二章耐力运动和高脂膳食对大鼠骨骼肌Calcineur
