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1、华中科技大学 博士学位论文 脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤血管新生中的作用及机制 研究 姓名：王雅丹 申请学位级别：博士 专业：内科学（血液病） 指导教师：胡豫 20070501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤血管新生中脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤血管新生中 的作用及机制研究的作用及机制研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院血研所 博士研究生 王雅丹 导 师 胡 豫 教授 摘摘 要要 第一部分第一部分 脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤患者血浆中的表达脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤患者
2、血浆中的表达 目的目的： 研究多发性骨髓瘤(MM)患者血浆中脑源性神经营养因子(BDNF) 、 血管内皮细 胞生长因子(VEGF) 的表达情况及与相应临床检测指标的关系，初步探讨BDNF在多 发性骨髓瘤的发生与发展中的作用。 方法方法：用酶联免疫吸附试验( ELISA) 测定MM 患者与健康体检者血浆BDNF、VEGF 的浓度,同时观察MM患者血常规、肾功能、电解质、影像学等指标。 结果结果：患者血浆BDNF 浓度为(4. 22 0. 64) 103 pg/ml，与健康体检者(2. 03 0. 38) 103 pg/ml比较， 差异有统计学意义( P 0. 05)； 患者血浆VEGF 浓度为(
3、79. 35 13. 25) pg/ml， 与健康体检者(34. 41 1. 78) pg/ml 比较， 差异有统计学意义( P 0. 01)。 BDNF 与VEGF水平间存在着相关性( r =0. 430 , P = 0. 025)。 结论结论： MM患者血浆BDNF和VEGF显著增高， BDNF可能是继VEGF后又一促进血管增 殖活性的细胞因子。 关键词关键词 多发性骨髓瘤；脑源性神经营养因子；血管内皮细胞生长因子 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 第二部分第二部分 多发性骨髓瘤细胞激活共培养内皮细胞脑源性多发性骨髓瘤细胞激
4、活共培养内皮细胞脑源性 神经营养因子自分泌环神经营养因子自分泌环 目的目的 在体外共培养体系中研究人 MM 细胞对正常内皮细胞的作用。 方法方法 建立人 MM 细胞株 RPMI8226 与正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外共 培养体系；以同期单独培养的 HUVECs 为对照，对与 RPMI8226 共培养的 HUVECs 进行 BDNF 及其特异性受体 TrkB 基因的半定量 RT-PCR 分析和蛋白的 Western blot 分析，采用 ELISA 的方法检测共培养体系培养上清中 BDNF 的含量；在转换共培养 实验的基础上应用 Transwell 小室迁移实验、网状结构形成实验评
5、价 RPMI8226 细胞 共培养激活的 HUVECs 对正常 HUVECs 血管新生能力的影响。 结果结果 与同期单独培养的 HUVECs 相比，经共培养后的 HUVECs 不仅上清中 BDNF 的含量增加分别为（12.45.1）103 pg/ml 和（31.67.2）103 pg/ml，P 0. 05，而 且RT-PCR结果显示HUVECs常规表达BDNF， 与RPMI8226共培养后HUVECs BDNF 表达量约为前者的 1.7 倍（P 0. 05） ；而单独培养的 HUVECs 几乎不表达 TrkB，共 培养的 RPMI8226 明显上调其 TrkB 的表达（为 4.4 倍，P 0.
6、 05）,Western blot 结果 与上述结果相符； 经 RPMI8226 活化的内皮细胞可明显促进 HUVECs 迁移和网状结构 形成，与未活化的内皮细胞相比迁移指数和网状结构数量分别增加了 99和 72， 抗 BDNF 抗体可部分抑制其活性。 结论结论 MM 细胞通过可溶性的细胞因子介导， 激活内皮细胞的 BDNF /TrkB 自分泌环， 继而实现内皮细胞的自促进血管新生效应。 关键词关键词 多发性骨髓瘤；细胞培养；脑源性神经营养因子; 血管新生 第三部分第三部分 AKT/eNOS 信号通路在信号通路在 BDNF 诱导内皮细胞诱导内皮细胞 血管新生中的作用血管新生中的作用 目的目的
7、探讨 BDNF 促进内皮细胞血管新生的机制及其参与的信号通路， 为抗多发性骨 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 髓瘤血管生成的研究提供新的实验依据。 方法方法 以 HUVECs 为对象，采用 Western 印迹方法检测细胞内磷酸化丝/苏氨酸激酶 （AKT）、内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS)蛋白质的表达；采用 Transwell 小室迁移实 验、网状结构形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力，小鼠体内 Matrigel plug 实 验评估体内内皮细胞血管新生的能力， 采用硝酸还原酶法检测 HUVECs 上清中内皮细 胞源性一氧
8、化氮（eNO）的含量，FITC-Annexin-/ PI 双染流式细胞术分析细胞凋亡。 结果结果 BDNF 以时间-浓度依赖性的方式激活 PI3K/ Akt/eNOS 信号通路， 应用 PI3K 激 酶抑制剂 Ly294002 可以明显阻断 BDNF 刺激后内皮细胞 eNO 的生成。 在体外， BDNF 诱导的细胞迁移和网状结构形成效应均分别能被 Ly294002 和 L-NAME （NOS 抑制剂） 阻断；而 BDNF 的抑制凋亡效应与 L-NAME 无关，仅受 Ly294002 影响；在体内，经 L-NAME 喂养的小鼠皮下 Matrigel 栓中的新生血管数量与未经 L-NAME 喂养的
9、小鼠 相比显著减少。 结论结论 BDNF 通过 AKT/eNOS 信号通路活化介导血管新生， 这可能成为治疗多发性骨 髓瘤血管新生的新靶点。 关键词关键词 脑源性神经营养因子; 血管新生; 信号通路 第四部分第四部分 表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立 目的目的 过去的研究证实 BDNF 在体外具有促进 MM 细胞增殖并诱导 MM 血管新生的 能力。为了进一步探索 BDNF/TrkB 途径是否为治疗 MM 的潜在靶点，我们建立人 MM 荷瘤小鼠模型， 并比较两种模型的优缺点， 为深入探索治疗 MM 的新靶点奠定基 础。 方法
10、方法 选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通过皮下注射或尾静 脉注射人骨髓瘤细胞株 RPMI8226 建立两种异体移植动物模型。荷瘤后观察小鼠的生 长状态、测量皮下瘤块的体积；荷瘤后 3 周，每周经眼眶后静脉丛采血，检测血清中 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 人源 LAM 轻链含量、Ca2+浓度和血浆中人源 BDNF 浓度，并计数红细胞；小鼠死后， 采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征，流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性 CD38 细胞比例，计算机 X 线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。
11、 结果结果 皮下注射模型的成瘤率高（5/5） ，具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征，但 其骨髓中未检测到 MM 细胞、血清中钙离子浓度不高、M 蛋白浓度升高不明显且未 发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低（4/7） ，骨 髓中可检测到呈浸润生长的人 CD38 细胞；而且在荷瘤 3 周后，血清中即可检测到人 源 M 蛋白；随着肿瘤的生长，M 蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高，并有溶骨性损害 的影像学证据。两种模型血浆中人源 BDNF 的水平亦逐渐升高，9 周时浓度分别为 （7311）pg/ml 和（10518）pg/ml。 结论结论 本研究成功建立了两种高表达 BDNF
12、的 MM 荷瘤 NOD/SCID 小鼠模型，两种 模型相互结合应用，为探索 MM 治疗的新靶点 BDNF/TrkB 提供了合适的动物模型。 关键词关键词 多发性骨髓瘤; 动物模型; NOD/SCID小鼠 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7 Study on Brain Derived Neurotrophic Factor-induced Angiogenesis in Multiple Myeloma Doctoral Candidate: Wang Ya-dan Tutor: Prof. Hu Yu ABSTRACT PART
13、 The expression of brain derived neurotrophic factor in multiple myeloma patients Objective: To investigate the expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in multiple myeloma patients and analyze the correlation of two cytokine levels to clin
14、ical parameters. Method: The plasma concentration of BDNF and VEGF in MM patients and control group were determined by ELISA. The results of patientsclinical examinations were recorded at the same time. Results: The concentration of BDNF were (4. 22 0. 64) 103 pg/ml and (2. 03 0. 38) 103 pg/ml in MM
15、 group and control group, respectively ( P 0. 05) . There was also a significant difference between VEGF levels of two groups (79. 35 13. 25) pg/ml vs. (34. 411. 78) pg/ml, P 0. 01. The levels of BDNF and VEGF correlated significantly (r = 0. 430, P = 0. 025). Conclusion: The concentrations of BDNF
16、and VEGF in MM patientsperipheral blood were at high level. BDNF is likely tobe a novel angiogenic protein. Key words Multiple myeloma ; Brain derived neurotropic factor; Vascular endothelial growth factor 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 8 PART Human multiple myeloma cell line RPMI8226 activated brain derived neurotrophic factor autocrine loop in co-cultured endothelial cells Objective To study the influence of multiple myeloma
