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1、实验四实验四 革兰氏染色法革兰氏染色法 一 目的要求: 1、学习并掌握革兰氏染色法。 2、了解革兰氏染色法的原理。 3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。 二、实验器材: 1.菌种: 大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌 16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 2.溶液或试剂: 革兰氏染液,草酸铵结晶紫染液,lugol碘液,95%乙醇,番红 复染液等。 3.仪器或其他用品: 酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶、擦镜纸、接种环、试管架 ,镊子,载玻片夹子,滤纸、滴管和无菌生理盐水等。 三、实验原理: 1、无菌操作技术: 高温对微生物具有致死效应,因为在微生物的转接 过程中,一般在火焰
2、旁进行,并用火焰直接灼烧接种环 ,以达到灭菌的目的,但一定要保证其冷却后方可进行 转接,以免烫死微生物。 2、细菌制片: 涂片法: 涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布,避免菌体堆 积而无法观察个体形态。 加热固定使细胞质凝固,使细胞固定在载玻片上 ,这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细 胞形态。 3、革兰氏染色: 革兰氏染色是丹麦医生Hans Christian Gram于1884年发明的 一种鉴别不同类型细菌的染色方法。 细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的结构和组分 的差异所决定的。 初染所有细菌都被染成结晶紫的蓝紫色。 碘媒染剂,与结晶紫结合成结晶紫碘的复合物,增强染 料在菌
3、体中的滞留能力。 脱色剂革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖含量高,壁厚且类脂质 含量低,乙醇处理可以使肽聚糖所具有的网状结构收缩使碘 结晶紫复合物滞留在细胞壁,菌体持原有的蓝紫色;革兰氏阴 性菌细胞壁肽聚糖含量低,交联度低,壁薄且类脂质含量高, 乙醇处理时,脂质溶解,细胞壁通透性增大,使结晶紫碘的 复合物比较容易被洗脱出来,菌体变为无色,用复染剂复染后 ,细胞被染上复染剂的红色。 四、实验方法 涂片干燥固定染色 水洗 干燥镜检 革兰氏染色法 涂片干燥固定初染 水洗 媒染水洗脱色水洗 复染水洗镜检 1min 1min0.5min 涂片:取干净的载玻片于实验台上, 在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水, 将接种环
4、在火焰上烧红,待冷却后从 斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌 或大肠杆菌)与玻片上的水滴混匀后 ,在载玻片上涂布成一均匀的薄层, 涂布面不宜过大。 干燥:涂片最好在室温下使其自然干燥, 有时为了使之干得更快些,可将标本面向 上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒 精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切 勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤 枯而变形。 固定:固定常常利用高温,手持载玻片 的一端,标本向上,在酒精灯火焰外层 尽快的来回通过23次,共约23秒钟, 并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不 觉过烫为宜(不超过60),放置待冷后 ,进行染色。 染色 (1) 初染:滴加结晶紫染液数滴 于涂片上1 分
5、钟,水洗; (2) 媒染:滴加碘液媒染1 分钟,水洗; (3) 脱色:滴加95 %酒精,轻轻不断摇动 玻片,使染液尽可能脱去,持续2030s, 水洗; (4) 复染:滴加稀释石炭酸复红染液数 滴于涂片上复染1 分钟,水洗。吸水纸 吸干,油镜观察。 细菌呈现第一次染色的 效果紫色,革兰氏阳性 菌(紫阳G+) 呈现第二次染色的效果 红色;称革兰氏阴性菌 (红阴G -) G+ 菌: 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 、甲型和乙型链球菌、枯草杆菌 G- 菌: 大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌 、卡他双球菌、淋球菌等 四、注意事项: 1、选用培养1824小时菌龄的细菌为宜,若细菌太老 ,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应 。 2、加热固定时要使用载玻片夹子,以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长,以免载玻片破裂。 3、革兰氏染色成败的关键是脱色时间,如脱色过度, 革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌;如 脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳 性菌。因此必须 严格把握脱色时间。 4、使用染料时注意避免沾到衣物上,乙醇脱色时勿靠 近火焰。 知识回顾知识回顾 Knowledge Knowledge ReviewReview