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1、南方医科大学2 0 11 级硕士学位论文 基于H A N D 系统的腹泻病原体多重P C R 检测方法的建立和应 用研究 E s t a b l i s h m e n ta n da p p l i c a t i o no fH A N D s y s t e m b a s e dm u l t i p l e xP C R a s s a y sf o rt h ed e t e c t i o no fd i a r r h e ap a t h o g e n s 课题来源：国家传染病科技重大专项一“传染病监测技术平台” 子项目( 2 0 0 9 Z X l 0 6 0 2 0 2
2、 ) 珠海检验检疫局科技计划项目( Z H 2 0 0 9 - 4 ) 、( Z H 2 0 1 3 1 ) 学位申请人滕勇勇 导 师姓名阿蚓副教授、莫秋华副主任技师 专 业 名称流行病与卫生统计学 培养类型专业型 培养层次硕士研究生 所在 学 院公共卫生与热带医学学院 答辩委员会主席陈维清教授 答辩委员会委员柯昌文主任技师 曾年华研究员 陈青山教授 陈清教授 2 0 1 4 年5 月2 8 日广州 悼念我的研究生导师一孙虹老师 山川含泪，草木皆悲，惊闻噩耗，悲痛万分，惋惜至极! 孙虹老师知识渊博、治学严谨，与老师学术交流时，常常使学生 醍醐灌顶，如坐春风! 孙虹老师平易近人、和蔼可亲，时常保
3、持灿烂的笑容和亲切的话 语，对学生的生活和学习关心备至! 孙虹老师爱岗敬业，恪尽职守，勤勤恳恳，在平凡的岗位默默地 奉献着，为珠海口岸的卫生事业做出了突出的贡献! 孙虹老师虽然走了，但她那种严谨的学术态度，为人师表的风范， 爱岗敬业、无私奉献的精神将永远铭记在学生心中，并以此为学习楷 模! 我一介晚辈，能作为老师的学生，实乃大幸，仅以此缅怀老师， 以表哀思，愿孙虹老师一路走好! 硕士学位论文 基于H A N D 系统的腹泻病原体多重P C R 检测 方法的建立和应用研究 硕士研究生：滕勇勇 指导教师：匦鲴副教授 莫秋华副主任技师 摘要 研究背景和目的 急性感染性腹泻( 简称腹泻) 一直是危害人
4、类健康特别是婴幼儿健康的常 见病和多发病，是全球范围内影响儿童和成人的重要公共卫生问题。引起腹泻 的病原体主要是病毒和细菌，但具体种类繁多，且常常伴有多种腹泻病原体复 合感染的情况，在实际检测中往往需要从这一系列的怀疑对象中确定腹泻病原 体，为腹泻病的快速诊断带来了极大的困扰。因此，建立一种高通量、高效的 腹泻病原体快速检测技术对于诊断、控制和及时治疗腹泻病具有重要意义。然 而，国内外对腹泻病原体实验室检测还很大程度依赖传统分离培养和生化鉴定， 但是分离培养和生化鉴定敏感性低、费时费力，需要一周左右才能完成，难以 达到暴发流行时快速检测的要求，而且有的病原体( 如诺如病毒) 目前还没有 合适的
5、细胞体系和动物模型进行培养。一些免疫学方法( 如酶联免疫吸附试验) 也被广泛的应用到腹泻病原体的检测，但其敏感性低，假阴性率高，容易造成 漏检，而且对于细菌来说需要预先将样本中的目标菌进行浓缩和纯化，短时间 内也很难得到结果，难以达到快速检测的要求。随着分子生物学检测方法的发 展，基于腹泻病原体的分子生物学诊断技术如P C R 、R T - P C R 、R e a l T i m eP C R 、 L A M P 等在腹泻病原体的检测以及腹泻病诊断方面发挥着重大作用，克服了以 T 摘要 上的缺点，特异性和敏感性较高，己成为目前腹泻病原体快速诊断的常规手段， 但这些方法一次只能检测一种病原体，
6、达不到高通量的检测要求，对于复合感 染的病例也容易漏检，而且R e a l 。T i m eP C R 仪器费用昂贵，检测成本较高，操 作复杂，不利于在基层实验室推广。基因芯片技术虽然具有高通量的特点，但 也存在技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度低且重复性差等难以解决的问题。多 重P C R 是一种相对省时、省力方法，可以在一个反应体系中同时检测多个病原 体，具有高通量、低成本的特点，但由于多重P C R 是多种不同引物混合，容易 形成引物问的相互干扰和引物二聚体，使得反应体系扩增效率不均衡，稳定性 差，而基于H A N D 系统多重P C R 可以有效的解决这些问题。 相同标签辅助无引物二聚体一
7、( H o m o T a gA s s i s t e dN o n - D i m e r ，H A N D ) 系 统，亦称同源加尾系统，是1 9 9 7 年B r o w i n e 为了消除P C R 中引物二聚体的产 生而设计的实验方法。该系统采用两种引物，即加尾引物( 3 端为特异性结合 序列，5 端为添加的通用尾巴序列) 和尾巴引物( 序列与加尾引物5 端添加的 通用尾巴相同) 。其基本原理首先是低浓度的加尾引物与模板特异性结合，扩 增形成两端均含有尾巴引物相同序列的初始P C R 产物：此时若加尾引物之间形 成引物二聚体，由于两端存在互补的序列，引物二聚体的单链会各自形成一个
8、 稳定的发夹结构，而该结构难以成为下一循环的扩增模板，从而大大的减少了 引物二聚体的形成；其次是待低浓度的加尾引物消耗完，高浓度的尾巴引物以 初始P C R 产物为模板进行特异性结合，直至扩增完成。所以将H A N D 系统与 多重P C R 结合的优点是可以有效地抑制引物二聚体的产生，提高多重P C R 体 系引物的容纳数量，减小各基因扩增效率的差异，使扩增均衡高效和稳定。因 此，本研究第一部分拟构建针对常见腹泻病毒、肠道致病菌、致病性弧茵三组 腹泻病原体的基于H A N D 系统多重P C R 检测方法，旨在为腹泻病的诊断寻求 广谱高效的快速检测方法。 弧菌是一类菌体短小，直或弯曲状的革兰
9、氏阴性细菌，兼性厌氧，广泛分 1 1 硕士学位论文 布于自然界，以淡水及海水中最多。弧菌有很多种，其中已经证明对人类具有 致病性的弧菌主要有霍乱弧菌( v i b r i oc h o l e r a ) 、副溶血弧菌( v i b r i o p a r a h a e m o l ”i c u s ) 、创伤弧菌( v i b r i ov u l n i f i c u s ) 、拟态弧菌( v i b f i om i m i c u s ) 和溶 藻弧菌( v i b r i oa l g i n o l y t i c u s ) 等。致病性弧菌广泛存在于温带和热带地区的海水、 海
10、底沉积物、浮游生物和水产品中，而因各种致病性弧菌污染水产品导致的问 题也越来越多。人类可以通过食用被弧菌污染的水产品而造成急性胃肠炎和败 血症等疾病，在影响人类的健康同时还可能因弧菌污染影响水产品养殖业的发 展。此外，水产品中的分离的致病性弧菌大多数是非流行株，但它们却是一些 弧菌毒素基因的保存库，而这些毒素基因的水平转移可能造成非流行株与流行 株的转变。因此，开展致病性弧菌的分子流行病学调查，可为防控致病性弧菌 感染引起的疾病提供有效信息。基于此，本研究第二部分拟利用构建的基于 H A N D 系统致病性弧菌多重P C R 方法对2 0 1 2 8 2 0 1 3 7 期间珠海、中山两地供
11、澳水产品中的致病性弧菌进行描述性研究，并了解弧菌的相关毒素基因的分布。 方法 1 基于H A N D 系统腹泻病原体多重P C R 检测方法的建立 首先选择A 组轮状病毒的V P 6 基因、诺如病毒的R D R P 基因、星状病毒的 N S P 基因、札如病毒的c a s p i d 基因作为4 种常见腹泻病毒的靶基因，选择志贺 氏菌的v i r A 基因、沙门氏菌的i n v A 基因、小肠结肠炎耶尔森菌的a i l 基因、金 黄色葡萄球菌的n u c 基因、大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 的r t b E 基因作为5 种肠道致病菌 的靶基因，选择创伤弧菌的v v h A 基因、霍乱弧菌的
12、o m p W 基因、副溶血弧菌 的t o x R 基因、拟态弧菌的V M H 基因、溶藻弧菌的g y r B 基因作为5 种致病性 弧菌的靶基因，根据靶基因的保守序列设计特异性引物并在5 端加上尾巴序列， 通过优化加尾引物和尾巴引物的浓度、M 9 2 + 浓度、D M S O 浓度、循环参数构建 三组基于H A N D 系统腹泻病原体多重P C R 反应体系，再分析其稳定性、特异 I l I 摘要 性和检测下限值，并运用于模拟的临床粪便样本检测，盲法试验评价方法的实 用性。 2 供澳水产品中致病性弧菌分子流行病学调查 2 0 1 2 8 2 0 1 3 7 期间，采用随机抽样的方法，每月抽取
13、大约1 2 5 份珠海、中 山两地的供澳水产品样，利用建立的基于H A N D 系统致病性弧菌多重P C R 方 法进行初筛，再将初筛阳性样品在T C B S 培养上分离培养和生化鉴定进行验证， 所得结果进行致病性弧菌的季节性、地域性和水产品种类分析；对分离到的阳 性菌株利用P C R 方法检测c t x A 、z o t 、a c e 、t c p A 、t d h 、t r h 、t l h 、v i u B8 个弧菌 毒素基因。 结果 1 基于H A N D 系统腹泻病原体多重P C R 检测方法的建立 ( 1 ) 成功构建基于H A N D 系统腹泻病毒多重R T - P C R 检测
14、方法。特异性 分析显示四种腹泻病毒间无交叉反应，敏感性分析显示轮状病毒、诺如病毒、 星状病毒和札如病毒的检测下限分别达到4 8 、9 6 、1 9 2 和4 8 p g ；盲法试验评 价结果显示符合率10 0 ； ( 2 ) 成功构建基于H A N D 系统肠道致病菌多重P C R 检测方法。特异性分 析显示五种肠道致病菌无交叉反应，特异性1 0 0 ，敏感性分析显示志贺氏菌、 大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 、小肠结肠炎耶尔森菌三种致病菌的检测下限值均为 1 0 0 c f u m l ，金黄色葡萄球菌的检测下限值为1 0 0 0c f u m l ，沙门氏菌的检测下限 值为1 0c f
15、u m l ；盲法试验评价结果显示符合率1 0 0 ； ( 3 ) 成功构建基于H A N D 系统致病性弧菌多重P C R 检测方法。特异性分 析显示五种致病性弧菌无交叉反应，特异性1 0 0 ，敏感性分析显示创伤弧菌、 霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌四种致病性弧菌的检测下限值均为1 0 0 c f u m l ， 拟态弧菌的检测下限值为10c f u m l ；盲法试验评价结果显示符合率10 0 。 硕士学位论文 2 供澳水产品中致病性弧菌分子流行病学特征 ( 1 ) 基本情况：共收集1 5 1 0 份供澳水产品样本，检出8 9 8 份阳性，弧菌 阳性率为5 9 5 ；复合感染样本5 6
16、3 份，复合感染率3 7 3 ，其中副溶血弧菌 和溶藻弧菌复合感染样本2 9 3 份，占5 2 ；具体霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤 弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌的阳性数分别为：3 2 9 份( 2 1 8 ) 、5 3 5 份( 3 5 4 ) 、 5 6 份( 3 7 ) 、1 0 8 份( 7 2 ) 、6 1 1 份( 4 0 5 ) ，其中霍乱弧菌中仅有2 株 O l 群小川型，5 株O l 群稻叶型，其余为非0 1 月E0 1 3 9 群； ( 2 ) 三间分布：在一年中的5 1 1 月份致病性弧菌总阳性率较高，而1 月 份和1 2 月份的致病性弧菌总阳性率较低，一年中每月弧菌的阳性率差异有统计 学意义( ? c 2 = 1 9 8 2 6 ，P = 0 0 0 0 ) ，供澳水产品中致病性弧菌主要在夏秋季流行； 珠海地区总弧菌阳性率6 9 5 高于中山的5 1 9 ，两地总弧菌阳性率差异有统 计学意义( f = 4 7 4 2 ，P = 0 0 0 0 ) ，珠海供澳水
