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1、微生物油脂的开发利用状况与研究进展摘要：综述了微生物生产油脂的发展历史及研究现状、微生物发酵法生产油脂的菌种、影响油脂形成的因素及微生物油脂的制取分析了存在的问题并展望其应用前景。关键词：微生物油脂；制备工艺；功能油脂 随着人口数量的爆发式增长，油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐。人们不得不积极开发替代化石燃料的可再生新能源，生物柴油就是一种具有巨大发展潜力的可再生清洁能源。目前，无论是食品油脂还是生物柴油原料油脂的主要来源都是植物以及动物脂肪，但是资源的匮乏远不能满足人们工业生产和生活对各种油脂的需求。所以微生物油脂的开发不仅丰富了传统的油脂工业，而且也必将是工业化生产油脂的一个重要
2、途径。 微生物油脂又称单细胞油脂，是酵母、霉菌、细菌、和藻类等微生物在一定条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂微生物油脂与传统的油脂工艺相比，除了油脂含量高外，微生物细胞增殖快，生产周期短，微生物生长所需的原料丰富，价格便宜，且用微生物方法生产油脂，比农业生产油脂所需的劳动力少，同时不受季节、气候变化的限制，能够连续大规模生产，生产成本低，可以利用高科技方法使微生物产出比动物、植物油脂更符合人们需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸油脂1。1 微生物油脂的研究历史及发展现状1.1 国外微生物油脂的研究 关于微生物产生油脂的研究已有半个多世纪的历史。国外对于微生
3、物油脂的研究工作起步较早，最早可追溯到第一次世界大战期间，当时德国准备利用内孢霉属和单细胞藻类镰刀属的某些菌种生产油脂，以解决食用油匮乏问题，后因战争爆发而中止研究。随后美国、日本等也开始研究微生物油脂的生产。第二次世界大战前夕，德国科学家筛选到了高产油脂的斯达氏油脂酵母、黏红酵母属、曲霉属以及毛霉属等微生物，并进行规模生产。后来发现利用微生物生产普通油脂成本太高，无法与动、植物来源的油脂相竞争。有关微生物油脂的探索此后一度集中在获取功能性油脂，如富含多不饱和脂肪酸的油脂。1986年，日本和英国等国家率先推出含微生物GLA油脂的保健食品、功能性饮料和高级化妆品等产品，微生物油脂实用化已迈出了第
4、一步。进入90年代，特种油脂的发展越来越受人们的重视。stewdansk和Radevan分别筛选到产生趾认的真菌，产生的总脂中ARA的质量分数达到42一55。1996年stredanska等从Pacificmarkarel的肠内容物中分离到一株叫SCRC一2378的海生细菌，能产生一种多烯不饱和酸，即二十碳五烯酸，其质量分数达24一40，被认为是EPA的一种新资源。1996年，Singh等在优化培养基上对Thraustochy triumATCC28210进行培养，5天后DHA产量达1061mg/L。研究者还发现某些海藻和硅藻也能生产出较高产量的EPA和DHA2。1.2 国内微生物油脂的研究状
5、况 我国在20世纪60年代就有生产油脂的报道，但研究较多的是在90年代，其研究重点也集中在开发功能性油脂方面。1995年，罗玉萍等3分离到一株高产棕榈油酸的酵母，总脂中棕榈油酸质量分数高达5014。1998年菌物系统报道，以拉曼被孢霉SM54l为原始菌株，经过紫外线复合氯化锂诱变处理，得到突变株SM54l一9，其生物量由126 gL提高到288g/L，油脂质量浓度由58g/L提高到157 gL，花生四烯酸质量浓度由32lgL增加到623 mg/L4。2003年，施安辉、周波通过对黏红酵母GRL531生产油脂发酵条件的探讨发现，油脂产量可达菌体干质量的672。清华大学缪晓玲5通过异养转化细胞工程
6、技术获得了脂类含量高达细胞干质量55的异养藻细胞。曲威等6以斯达氏油脂酵母为出发菌株，经紫外线诱变选育出了一株高产油脂的优良酵母菌株，生物量可达242 gL，油脂质量浓度146 gL。李永红等7采用均匀设计和单因子试验法，通过摇瓶培养所得菌体油脂质量浓度高达761，脂肪得率系数可达227。孔祥莉等8研究了斯达氏油脂酵母利用葡萄糖木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性，发酵120 h后混合糖利用率、生物量和菌体油脂质量分数分别达995、190g/L和526。2 产生油脂的微生物菌种2.1 产油微生物必备的条件(1)具备或改良后具备合成油脂能力，油脂积累量大含油量稳定在50以上，且油脂转化率不低于15
7、。(2)能进行工业化深层培养，培养装置简单。(3)食用安全，具有良好的风味和易消化吸收性。(4)油脂易提取。2.2 常见产油微生物种类2.2.1 细菌 嗜酸乳杆菌CRL640、混浊红球菌PD630、弧菌CCUG35308等。混浊红球菌PD630在葡萄糖或橄榄油中生长时，甘油酯中的脂肪酸含量占细胞干重的76一87。弧菌CCUG35308脂肪酸主要为偶碳链脂肪酸。2.2.2 霉菌 深黄被孢霉、高山被孢、卷枝毛霉、米曲霉、土曲霉、雅致枝霉、三孢布拉氏霉等。被孢霉属，主要用于研究生产GLA和AA；三孢布拉氏霉则主要用于发酵生产一胡萝卜素。2.2.3 酵母 弯假丝酵母、浅白色隐球酵母、胶黏红酵母、斯达氏
8、油脂酵母、产油油脂酵母等。一般油酸是酵母中最丰富的脂肪酸，其次是亚油酸。红酵母和假丝酵母可用于开发生产可可脂及其代用品。2.2.4 微藻盐生杜氏藻、粉核小球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、新月菱形藻等。微藻主要用于生产EPA、DHA。由于细菌产量低，且不适合工业生产目前主要集中在真菌和藻类。3 微生物产生油脂机理 微生物产生油脂过程，本质上与动植物产生油脂过程相似，都是从利用乙酰COA羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长，或再经去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程。其中去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径、生成不饱和脂肪酸的关键酶，该过程称之为脂肪酸氧化循环。 禹慧明等对产生GLA机理
9、进行探讨，认为微粒体膜的苹果酸酶活性与菌体油脂GLA含量存在显著相关关系，这是因为苹果酸酶原位产生的NADPH是微粒体膜磷脂上脂酰基完成去饱和作用的关键所在，而胞基质上的NADPH在脂肪酸延长和去饱和中不能发挥作用。Kendrack等发现苹果酸能促进卷枝毛霉微粒体的去饱和作用，使GLA含量增高，这可能是苹果酸酶为去饱和作用而提供NADPH结果9。综合目前国外的研究，粘红酵母油脂合成的机理可分为4个环节：两个前体乙酰COA和3-磷酸甘油的形成；甲羟戊酸的合成，乙酰COA形成脂酰COA和鞘脂；以甲羟戊酸为前体合成甾醇、类胡萝卜素和碳水化合物；以乙酰COA和3-磷酸甘油为前体合成磷脂酸、甘油二脂、甘
10、油三脂和磷脂。由此可见，在酵母细胞内油脂的合成多少，乙酰COA起了主导作用，而乙酰COA的形成又受氮源多少、AMP和异柠檬酸脱氢酶活力等诸因素的影响10。4 微生物合成油脂的影响因素4.1 培养基组成 培养基中氮源浓度和CN比是影响微生物油脂含量主要因素。一般来说，培养基中含氮化合物越多，则细胞蛋白质含量越多；缺乏含氮化合物，则油脂积累。当培养基中氮浓度一定时，增加碳源可增加菌体油脂含量。当然对碳、氮源的绝对羞有限制，氮源太少则细胞的油脂含量多而细胞增殖显著减少：碳源太多则渗透压增大而使细胞收获量减少。因此在实际生产中，培养初期供给大量氮源使微生物迅速增殖，以获取大量菌体细胞，后期改为含糖量多
11、的培养条件以使油脂积累，这样可从蛋白质合成初期百分之几的油脂提高到后期百分之几卜的油脂含量。此外，氮源的种类也会影响油脂的积累11。4.2 培养时间 微生物细胞的油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异，如油脂酵母Lipomyces starkeyi的油脂含量在生长对数期较少，在生长对数期末期开始急剧增加，至稳定期初期达最多。培养时间的长短也有重要影响，培养时间不足，菌体总数少而影响油脂产量：培养时间过长，细胞变形、自溶，合成的油脂进入培养基中难以收集，同样影响油脂产量。此外，不同微生物的最佳培养时间也不相同，如黑曲霉、米曲霉、根霉、红酵母、酿酒酵母的最佳培养时间分别为3d、7d、7d、5d
12、、6d。4.3 无机盐类 对真菌而言，适当增加无机盐和微量元素的添加量，能提高油脂合成速度和产油量。Carrido等人对构巢曲霉Asppergillus nidulans的研究结果表明，调整培养基中Na+、K+、Mg2+、SO 42-、P043-等的含量比，可使油脂含量从2526(油脂生成率677 9)提高到51(油脂生成率17，2)。长沼等人通过研究油脂酵母发现，增加培养基的铁离子浓度可使油脂合成速度加快，而增加锌离子浓度可使油脂含量增加。一般讲，在比生长最适浓度稍高的盐浓度下油脂会积累，但太高时就被阻止。4.4 温度 温度会影响油脂的含量和组成。通常油脂合成的最适温度为25;低于20或高于
13、40，油脂产量均明显降低；培养温度较低时油脂中不饱和脂肪酸含量增加。4.5 pH值 不同种类的微生物产油的最适pH也不同，酵母为3 56 0，霉菌为中性至微碱性。构巢曲霉Asppergillus nidulans在pH2 87 4培养时，随pH值上升，油酸含量增加。油脂酵母Lipomyces starkeyi培养基的pH值越接近中性，稳定期菌体的油脂含量越高。4.6 通气量 微生物利用糖类基质合成油脂及不饱和脂肪酸时都需要氧气，因此必须供给充足的氧。4.7 其它添加物 在培养基中添加乙醇、乙酸盐、乙醛等脂肪酸合成的中间产物或能形成中间产物的C2化合物可增加油脂含量，有些菌株还要求B族维生素。添
14、加EDTA可抑制糖和盐类复合物的形成，减少同化性糖损失并增加油脂含量。5 微生物油脂的基本制备工艺流程微生物油脂的生产工艺流程如下：菌种筛选原料灭菌菌体培养菌体收集预处理油脂提取。5.1 茵体的活化将菌种接到斜面培养基(如YPD、麦芽汁培养基)，培养23 d。5.2 茵体培养 种子液的制备。将活化的菌种以少量的无菌水洗入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在适宜温度，适宜的转速条件下摇床培养13 d。接种摇床培养。将种子以一定的接种量接到液体培养基中在适宜的温度和转速条件下摇床培养一定时间。5.3 茵体的收集 将培养好的茵体经镜检，离心收集，烘干称取干重，测得生物量。5.4 苏丹黑
15、染色法定性分析菌体内脂 培养好的菌体按常规方法涂片、热固定，用苏丹黑B染色15 min，倾去染料，二甲苯冲洗至洗脱液无色，再用沙黄复染2 min，水洗、吸干后镜检。细胞和菌丝呈红色。菌体内的脂肪颗粒呈蓝黑色12。5.5 残糖的测定 以斐林试剂法测还原糖含量。在正交实验中则采用铁氰化钾法(GB5513一1985)测定。5.6 预处理 微生物油脂大多存在于由较坚韧的细胞壁所包裹的菌体细胞内，部分与蛋白质或糖类结合以脂蛋白、脂多糖的形式存在，较难分离出来，因此在提取油脂前必须对菌体进行前处理。前处理方法主要有掺砂共磨法（将菌体与砂子一起进行研磨）、与盐酸共煮法（共煮使细胞分解有利于获得油）、菌种自析法和蛋白质溶剂变性法（用乙醇或丙醇使结合蛋白变性）、反复冻融、超声波破碎等方法。5.7 油脂的提取 用于油脂浸提的溶剂应该使全部油脂物质都能溶解而且要求有足够的极性使其与细胞膜、脂蛋白等连接键破坏而得以提取。目前，研究者常采用油脂提取方法有：酸热法、索氏提取法、超临界CO2萃取法（SCF-CO2法）、有机溶剂法。5.8 油脂分析方法 提取所得油脂需要对所含总油脂定性、定量分析以及对其组成和各组分含量进行分析检测。目前
