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1、冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。其缺点是组织过大不易
2、冰冻，连续切片困难。5微米以下切片不易成功。但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。1恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。目前恒冷箱切片机的品种较多。此种切片适用于科研和教学上的连续切片。要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。2甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。3二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷
3、冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。4半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。明胶冰冻切片正是适用于上
4、述情况。环保组织固定液固定后必须充分水洗，洗净。因甲醛对明胶有凝固作用，从而影响明胶溶液浸入组织内部,不宜选用含甲醛类固定液。组织水洗后浸入12.5%明胶水溶液(以1%石碳酸水溶液配制)，于37温箱浸6-24h。移至25%明胶溶液内浸6-24h。25%明胶包埋，连同包埋器放入冰箱内使明胶迅速凝固，取出后在空气中蒸发10min 。入环保组织固定液固定明胶块1-2日。蒸馏水洗后，置冰冻切片机或滑动式切片机切片。切片可保存于10%甲醛液中。依检查目的而进行染色，染色后一般不经乙醇脱水及二甲苯透明，而用下述明胶溶液或其他类似的明胶溶液封片：果糖26g,明胶1.1g，钾矾0.75g，麝香草酚水溶液1.1
5、5ml。先将果糖溶于麝香草酚饱和液，置于56温箱内12h，加明胶后在水浴内加温熔化，过滤后加钾矾。于100ml溶液内加甲醛2ml防腐。三、冰冻切片粘片法1蛋白甘油粘片法冰冻切片粘片法基本上按石蜡切片的粘片处理，但烘烤的温度不超过40。待烤干后立即取出，时间过久或温度过高则切片易破碎。烤干后用70%乙醇及蒸馏水洗后即可染色。2Lillie明胶粘片法将切片放入1%明胶水溶液数分钟，捞出置于载玻片上，将多余液体倾去。入环保组织固定液中固定5min,水洗10min，即可染色。3乙醇明胶粘片法切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液（以40%乙醇配制）数分钟，捞于载片上，经室温短时干燥，入氯仿1min ,经
6、95%及70%乙醇洗去氯仿，再经蒸馏水洗后染色。四、冰冻包埋液包埋切片 OCT Compound 法现在国内外有许多厂家用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘（chuck）上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。常规切片，厚度2-100微米。或者在盛标本的包埋模具内，挤出适量冰冻包埋液，放入组织块或细胞沉淀块，加包埋剂完全淹没组织块，如有气泡可用针头或吸头吸出。速冻：将盛有组织细胞和包埋液的模具，正置于切片机冷室内冰冻10分钟，至包埋液固化。也可将盛有组织的模具置于液氮或-40-70度冰箱冰冻固化保存，用前取出置于切片机冷室内
7、平衡温度（否则损坏刀片）。冰冻包埋液是由高分子聚合物组成的透明粘稠液体，速冷时固化，其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近，因此能保证最佳O.C.T.，并具有支持填充、减少皱褶和断裂的作用。能切出2-3微米的超薄切片。国内较好的品牌有西奈山冰冻包埋液。冰冻切片组织块的准备1.调整好组织与刀片的方向这是冰冻切片准备中极为重要的方面，使用冰冻切片组织包埋液可以使这项工作变得简单，在我的工作中我总结出一些经验可供参考。a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不够，对绝大多数组织均合适的温度却切不好脂肪组织，如果一刀下去，组织中的脂肪先接触刀片，就会破碎并使整个片子损坏。如果脂肪最后接触刀片，则切片过程不受干扰。
8、最糟糕的情况是脂肪部分先接触刀片而没有冰冻切片包埋液（如西奈山品牌）的保护，冰冻包埋液可以给片子提供一个起始的缓冲，如果没有包埋，脂肪就会切碎并把整个片子破坏。当切片过程中由于脂肪的出现而影响质量时，我要么把摇柄转回去尽量避免，要么把脂肪挖出来。b.组织与刀片垂直或成角是关键。让我们假设组织由起始端、中间部分及末尾端三部分构成，起始端容易卷缩，或受到刷子的损害，还可能由于操作者的犹豫而引起片子的厚薄不均，这些都增加了假象的风险。末尾端在贴片时容易拉长，最好的是中间部分，最不可能出现假象，并且组织学上最干净，这是片子中最理想的部分。非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。成角
9、包埋就像坐着船冲浪一样，如果你直线行驶，就会承受波浪线上最大的冲击，如果成角行驶，波浪线就会拉伸，所受的颠簸也会减小。跟公路上的减速脊一样的原理。上皮和粘膜贴附的组织如皮肤，胃肠，膀胱，子宫，颈部等，应当使上皮面垂直于刀片（见下图）。2.组织块的温度任何组织都有一个理想的切片温度，在此温度下切片，组织片以平滑均一的形式流过刀片，几乎没有卷缩。当温度、组织类型、刀片均处于理想状态时，切片十分流畅，几乎不用刷子。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。如果需要加温，只需要把大拇指置于组织块面几秒钟；如果需要降温，可以使用机子的精确低温包埋系统，简单的做法就是把过冻的冻台放
10、在组织面上几秒钟，大多数的冰冻切片机都有一种热吸收器可以使用。3.组织块的填涂基本的修复填涂可以解决组织块自身的缺陷，下面我举几个具体的例子。(1)扁平包埋组织的填涂包埋扁平的组织时，只有一层薄薄的包埋物贴附在底面，而且包埋物会轻微地收缩与组织块分离，如果想以最小的休整开始切片，那么收缩的空间必须填涂上包埋物，如果不填涂，切片时组织便会与包埋物分离，从而很难获得一张完整的片子。下面这个简单的技巧可以使你获得一个整齐的组织面。0(2) 针头的移除在工作中经常会收到布满针头的标本，有时候针头会穿过整个组织，导致刀片的损坏并使片子一分为二，下面有一种简单的解决办法。0接到标本后快速冰冻。2、切片厚度
11、67微米。3、切片完整，无污染，无皱褶。4、切片完成后立即固定。5、染液，脱水液必须及时更换。6、封固前必须经酒精脱水，环保组织液透明，湿封。7、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。8、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚。9、制片工作一般应在1520分钟内完成。10、冰冻报告后及时将“冰对”组织放入环保组织固定液内。11、每天操作完成后，及时对机器进行清理和消毒。（3）缝线的移除同样的方法移除组织块中的缝合线 0（4）挖凿的技术当组织块中某些部分不需要或阻碍我们获得高质量的切片时，我们就可以将它挖除掉。最好的例子就是脂肪组织干扰切片，常见于切除的淋巴瘤用于检查是否癌转移。如果脂肪先于组织块中
12、的其他部分接触刀片，你首先可以试着转动组织块，如果不行，就可以将它挖掉，然后用冰冻包埋液填充。0学会看片子这里指的是片子滑过刀片时就要辨别出质量的好坏，如果到镜下才发现片子的缺陷那就无法挽救。1.观察片子的厚薄尽管冰冻切片机可以设置厚度，但人为辨别片子的厚度是否合适仍然很重要。片子太薄看起来象半透明的镜纸，片子太厚看起来混浊、柔性差，对我来说，5-6um的片子较合适，象一张薄的打印纸。 03.片子上的条纹垂直于刀片的细条纹为刀片缺口所致，这往往是切到钙化组织、针头或缝线的结果。 4.波浪线样的横皱这是切片机零件松动的征象，可能需要修理，切片时刀片有移动或支撑刀片的机子有移动时，往往有这种规则的
13、条纹出现。为了获得干净整齐的片子，所有固定刀片、刀架、支撑台、支撑栓子及切片机的旋钮、螺钉、轴承都必须上紧，并且不带有垃圾残骸，支撑台或刀片下面有一点包埋物都会影响切片的质量。脂肪组织的处理脂肪组织无疑是冰冻切片者的绊脚石，道理很简单脂肪不会结冰，把温度降低让脂肪变硬可以切出较薄的片子，但是这个温度对同一组织中的其他成分来说显得太低而不合适切片，当脂肪破碎影响切片时这个问题就变得明显，下面是一些我的经验总结。1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织当我准备切淋巴结时，我会先检查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓内的脂肪，结内的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜线附近的脂肪用刀切除，这样就不需要切开整个淋巴结被膜。有人
14、会说，我把一些组织去掉后，可能导致漏判一些阳性的淋巴结，但我的经验是好的干净的片子比含有太多脂肪的差片子更容易获得阳性的结果。当你在休整组织或切片的过程中脂肪组织意外出现时，你也可以使用前面的挖凿技术。2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片切片时尽量避免脂肪先接触刀片，因为脂肪会脱离包埋物，在切片上留下一个洞，如果不能避免，也要在其周围加上包埋物，让包埋物先接触刀片。3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度切片机的台面和刀片必须保持干净，假如你弄碎了一张片子必须即时用一块干纱布清理干净，但要防止刀片割手，如果你发现切出来的片子有条纹或者堆积成束，可能是组织粘着在刀片的下方了，必须除掉刀片上的
15、组织，并将刀片清理干净。组织块越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪组织就变得坚硬难切，同时水性的组织会裂开，这就有必要在切片温度的最冷端和最温端取一个二者兼顾的中间值，以使脂肪和非脂肪组织都能切好。我一般将组织块冻在-24度，可以获得满意的结果，冷冻喷雾剂有用，但要注意先清掉切片机内的污秽。4.灵活地转动摇柄而不犹豫假如组织块是脂肪和结缔组织的混合物，那要好切于纯脂肪组织，有时候按照我前面所讲的技巧来做，片子会出乎意料的好。用运动的刷子快速粘住组织片并把它拖上台面，不要把刷子和组织片压上台面，以免粘在一起使切片完全中断。同样，好的刀片也很重要，如果你能用刷子敏捷地做出这套动作，那你肯定也能对脂肪组织切出理想的片子，脂肪在片子上会留下空的间隙，但它们之间的纤维条却保存完好。下面这块乳腺癌及其周围有数毫米覆盖着墨水的脂肪组织，假如你调整好组织块的方向使脂肪边缘垂直于刀片，肿瘤组织就切得好，脂肪切片的角度会有变动，也会留下空隙，但总有一条墨迹线指示着边缘的所在。很多时候我都用这种方法来区别肿瘤和脂肪组织。0冰冻切片的基本技术1.从锋利的刀片开始 我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位
