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1、上海交通大学 硕士学位论文 氰戊菊酯经Tn细胞代谢前后结构的变化 姓名：赵修文 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：乔中东 20081201 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 3 氰戊菊酯经氰戊菊酯经 Tn 细胞代谢前后结构的变化细胞代谢前后结构的变化 摘摘 要要 氰戊菊酯(Fenvalerate, (RS)-氰基-3-苯氧基苄基(RS)-2-(4-氯苯基)-3-甲 基丁酸酯)，是一种广泛用于农林害虫和疾病传播媒介防制的 II 型拟除虫菊酯类 农药。由于农药的长期大量使用，很多昆虫对农药产生了抗性，使得农药的用量 大量增加，带来了一系列的环境问题。然而，
2、关于昆虫对化学杀虫剂产生抗性的 机制迄今仍不十分清楚。我们实验室前期研究表明，经氰戊菊酯处理过的粉纹夜 蛾(Trichoplusia ni , Tn) 的细胞系，细胞内的 P450 含量增加，经蛋白组学研究 显示，这些 P450 中为三种羟化酶。因此，我们假设：氰戊菊酯被 Tn 细胞得羟 化酶催化羟基化后，使之水溶性增加，并改变了其与空间构象，不能与细胞表面 的受体结合，从而产生了抗药性。本实验目就是为了验证经 Tn 细胞代谢后的氰 戊菊酯的结构是否与我们的预测相一致。 我们首先用浓度为 12.5M/L 的氰戊菊酯处理 Tn 细胞 12h 后，回收昆虫细 胞及其培养液，利用乙醚萃取法从 Tn
3、细胞及其培养液中提取氰戊菊酯及其衍生 物，再通过硅胶柱分离纯化氰戊菊酯的衍生物。经 1H-NMR，13C-NMR 检测后， 解析出氰戊菊酯衍生物的结构，由质谱分析确定氰戊菊酯衍生物的分子量，元素 分析测定氰戊菊酯衍生物中的 C，H，O，N 含量从而对 1H-NMR，13C-NMR 解 析出的氰戊菊酯衍生物结构进行确定。 我们的研究结果发现氰戊菊酯经 Tn 细胞代谢后，氰戊菊酯结构发生变化， 其中氰基被还原，苯氧基被羟基所取代。 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 4 虽然，大量的研究发现，昆虫对化学杀虫剂抗性产生的主要机制是通过细胞 内 P450 酶系的解毒体系实现的， 但我们
4、的研究结果却展示了氰戊菊酯上的氰基 被还原，使之毒性降低；苯氧基被羟基所取代，使之水溶性增加，以及结构发生 较大的变化等。氰戊菊酯上的苯氧基被羟基取代即可能是羟化酶的催化的结果， 也可能是其它水解酶水解的产物。因此，要想了解昆虫细胞对化学杀虫剂产生抗 药性的具体机制，尚需大量的后续工作才能得出有用的结论。 关键词：关键词： Tn 细胞，氰戊菊酯，核磁共振，质谱，P450 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 5 Structure Modification of Fenvalerate During Trichoplusia ni（Tn）Cell Metabolism Abstr
5、act Fenvalerate, a useful synthetic pyrethroid pesticide, is effective in controlling insect populations and has a low toxicity to mammals. Many insects developed resistance because of the long term use of fenvalerate. The long term use of fenvalerate also caused a series of environment problems. Ho
6、wever, the resistance mechanism of insect is still in research now. Our previous research showed the contents of P450 in insect cells increased after the Trichoplusia ni(Tn) cells was treated by fenvalerate. The research of proteomics showed three isozymes of P450s were hydroxylase. Our hypothesis w
7、as that fenvalerate was hydroxylated by hydroxylase. The structural changes resulted in its derivative could not bind the receptor on Tn cell. The purpose of this research is to test if the structure of fenvalerate derivative was consistent with our prediction. First, we treated Tn cells 12h with 12
8、.5M/L fenvalerate. Then the fenvalerate and its derivatives were recovered and purified from the culture media by ether extraction and silica gel column chromatography. At last, the structure modifications of fenvalerate were detected by Nuclear Magnetic Resonance Apparatus, Mass Spectrometer and el
9、emental analysis. The structure of fenvalerate derivative showed that the cyano was reduced and the phenoxyl group was substituted during the metabolizing 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 6 process in Tn cells. Previous study showed insects cytochrome P450 was an important role in the metabolism of insecti
10、cides. But our research showed that the cyano was reduced to reduce toxicity and the phenoxyl group was substituted to increase its water solubility during the metabolizing process in Tn cells. The phenoxyl group was catalyzed either by hydroxylases or by the other hydrolases. Thus, more subsequent
11、research is required to declare the concrete mechanism of drug resistance. Keywords：Trichoplusia ni（Tn）; Fenvalerate; Nuclear Magnetic Resonance Apparatus; mass spectrometer; Cytochrome P450 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 1 上海交通大学上海交通大学 学位论文原创性声明学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经
12、注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成 果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：赵修文 日期： 2009 年 2 月 2 日 上海交通大学硕士学位论文 上海交通大学硕士学位论文 2 上海交通大学上海交通大学 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索
13、，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密保密，在 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密不保密。 （请在以上方框内打“”） 学位论文作者签名：赵修文 指导教师签名：乔中东 日期： 2009 年 2 月 2 日 日期： 2009 年 2 月 2 日 上海交通大学硕士学位论文 1 第 1 章 绪 论 第 1 章 绪 论 在长期使用化学杀虫剂后，昆虫能产生抗性，这种抗性能遗传，在世代中不断 累积，直到此杀虫剂完全不起作用。 细胞色素 P450 具有可诱导性，所谓 P450 的诱导是指某一细胞色素 P450 的水 平能够在暴露于某药物或其它异源物质后而显著增加，是化学
14、刺激物通过解毒酶增 加而使解毒作用增加的过程。 可诱导性是 P450 酶系的重要特征， 昆虫和哺乳动物一 样，普遍存在 P450 的诱导现象。许多不同结构的化合物，如药物、杀虫剂和植物次 生性物质都能诱导 P450 的生物合成。已有的研究表明，昆虫 Trichoplusia ni 细胞通 过 P450 体系过表达对氰戊菊酯进行代谢，从而产生抗药性。 1 昆虫 P450 多样性及其功能 1 昆虫 P450 多样性及其功能 化学异物(包括药物)在生物体内的转化有其相关的酶系，药物代谢酶与免疫系 统并称为机体的“清洁系统” 。 生物转化实际上包括两个相互衔接的连续阶段，在 第 1 期，是向底物分子引
15、入极性基团，增加分子的极性，P450 酶系参与了生物转化 的第 1 期反应，代谢成相应的产物，使化合物的极性增加，利于排泄；第 2 期是结 合反应，极性分子与体内葡萄糖醛酸、甘氨酸或硫酸等结合成水溶性更大的结合物， 可随尿或胆汁排出体外，如谷胱苷肽 S 转移酶即是参与第 2 期反应的酶 1。人类 与哺乳类动物的生物转化主要在肝脏微粒体， 由细胞色素P450酶系(亦可简称P450) 代谢转化。细胞色素 P450(cytochrome P450，CYP450)酶系，是生物体的主要相 代谢酶，又称多功能氧化酶(mixed-function oxidases，MFO)或细胞色素 P450 单加 氧酶系
16、(monooxygenase)，是存在于几乎所有的生物线粒体或微粒体上的具有氧化 功能的一个酶系统，P450 是整个酶系的末端限速酶，因此也是此酶系的核心酶，或 关键酶2。P450 是一类色素蛋白，因该酶系还原后与一氧化碳结合后形成复合物， 上海交通大学硕士学位论文 2 于波长 450nm 处呈现典型的吸收峰而得名。细菌的 P450s 是可溶的，而真核生物 的 P450s 是膜蛋白，结合于内质网膜或线粒体膜上3，4。P450 是一类很大的超家 族蛋白，拥有大量数目的成员，仅真核生物中 P450 的家族数目就达 50 余个，每个 家族中又有若干亚家族，是各种生物大分子超家族中比较典型的代表。由于其成员 的多样性， 使 P450 酶系能参与生物体内的各种合成代谢和分解代谢， 如各种信号分 子如激素，维生素，oxylipins 等，但他们被关注最多的还是对外源化合物的代谢。 它们能对外源化合物氧化，硫化，羟基化，羧基化，使外源化合物被氧化而失活， 具有解毒功能，从而使生物对此种化合物产生抗性；在少数情况下也可能使外源化 合物氧化而
