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1、CHAPTER 5 植物原生质体培养和细胞杂交 第一节 植物原生质体培养 第二节 细胞融合（细胞杂交） 第三节 以原生质体做受体的遗传转化 第一节 植物原生质体培养 原生质体的概念： 植物细细胞原生质质体（protoplast） 一词词始于Hanstein（1880），在植物学 上它是指植物细细胞通过质过质 壁分离后可以 和细细胞壁分开的那部分细细胞物质质。 原生质体培养的应用： 1 植物育种 2 打破有性杂交的局限（自由杂交局限、减数 分裂局限、胞质基因局限）进行育种 3 遗传转化 4 避免细胞壁上核酸酶对外源基因的破坏 5 利用原生质体瞬间表达系统 6 理论研究 细胞起源、细胞壁再生、质膜
2、结构和功能、 核质关系、胞间作用、激素作用机理等。 一 植物原生质体研究历史与现状 1、机械法分离原生质体时期 1892年由Klercker用于从质壁分离的 Stratiotes aloides 细胞分离原生质体；随 后为Chambers和Hofler（1931）将洋葱 表皮组织的薄片浸在1.0mol/L 蔗糖溶液中 ，当原生质体收缩脱离壁时用快的刀片切 开表皮细胞，获得了少量表皮细胞的原生 质体。 2、酶法制备原生质体阶段 1960年英国Nottingham大学植物学 系Cocking首次用纤维素酶从番茄幼苗 的根分离得到原生质体，从此开创了用 酶法分离植物原生质体的时期。其后纤 维素酶、半
3、纤维素酶、果胶酶的商品化 ，使得实验室制备原生质体成为一中常 规技术。 二、植物原生质体研究进展 1、分离方法的改进：商品酶的 出现，从各类植物以及不同的 器官、组织，都成功地分离到 原生质体。 2、原生质体培养技术日趋成熟： 培养基、培养技术的改进极大地提高 了培养的效率。现在常用的琼脂糖包埋培 养（包括琼脂糖块周围加液体培养基的方 法）、液体浅层培养、使用条件培养基或 饲喂培养等技术，以及发展出来的一些专 门实用于原生质体培养的培养基如KM8p 、VKM、D2a等的广泛使用，均极大改 善了培养效率。 3、性细胞原生质体研究： 花粉原生质体、精子和生殖细胞、胚囊 及其组成细胞分离成功；单个原
4、生质体培养 成功，使人们可以尝试在离体条件下对这些 细胞进行操作，发展了雌雄配子的融合技术 ；培养小麦和大麦的受精卵形成的原生质体 发育形成完整植株；利用花粉四分体原生质 体与体细胞原生质体融合获得三倍体杂种植 株等。 4、原生质体遗传操作： 利用原生质体导入外源DNA获得转 化植物，在多种植物中获得成功，已由 大豆、杠豆、柑橘、多种芸薹属植物、 水稻、高粱、玉米、小麦等作物获得转 基因植物；建立起有效的叶绿体转化试 验系统；植物病毒在原生质体中增殖系 统等。 三、植物原生质体的分离和培养 一）、 原生质体的分离 机械法 酶法 影响原生质体分离质量因素： 酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原 生
5、质膜的稳定剂、酶解时间与温度、分离与 纯化的方法等。 1、材料的选择： 要获得产量高，质量好且容易分裂的原生质体 ，就要注意用于制备原生质体的起始材料的特性和 生理状态。 茄科植物一般选择生长旺盛、生理状态一致的刚展开的幼 嫩叶片分离原生质体。 十字花科植物，一般认为是从种子萌发45天的无菌苗下 胚轴分离原生质体，得率高、活力强、再生频率高。 豆科用未成熟种子胚的子叶较好。对禾本科植物，从幼胚 、幼穗、花药或成熟胚建立胚性愈伤组织及其胚性悬浮细胞系 分离原生质体有利于其后的再生。 2、酶制剂： 植物的细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果 胶质构成。一般而言，纤维素约占细胞壁干重的 25%50%不等
6、。半纤维素约占细胞壁干重的53%左 右，果胶质一般约占细胞壁的5%左右。 双子叶植物的叶片，需用纤维素酶和少量果胶 酶 愈伤组织细胞及其悬浮细胞除用纤维素酶外， 还需用较多的果胶酶，有些材料还需加入半纤维 素酶。 花粉小孢子壁除含有纤维素、果胶质外，还有 胼胝质，分解时需用蜗牛酶或胼胝质酶。 3、渗透压的稳定剂： 酶液、洗液和培养液中渗透压应和原生质体内的相 同或接近，渗透压略大些有利于原生质体的稳定，过大 会使原生质体收缩并阻碍原生质体的启动分裂。 广泛使用的渗透压调节剂使甘露醇和山梨醇、蔗 糖、葡萄糖和麦芽糖，其浓度约在0.40.6mol/L。 加入CaCl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾都
7、可以提高原 生质膜的稳定性，增加完整的原生质体数目和活力。葡 聚糖硫酸钾是通过降低酶液中核糖核酸酶活性，而有利 于原生质膜的稳定。 4、酶解处理 酶解植物材料处理：表面灭菌，材料分割 。 酶的用量：植物材料应按比例和酶液混合 才能有效地分离原生质体，一般叶片、子叶 切条和下胚轴切片需酶量少，而胚性愈伤组 织和胚性悬浮细胞则用酶量大。 渗透剂的选择：小麦和水稻胚性悬浮细胞 ，用葡萄糖作渗透剂优于甘露醇 酶解条件：PH值，时间，温度。 5、原生质体的纯化 沉降法：用过滤和离心相结合的方法。 漂浮法：采用较原生质体比重大、渗透压高的 溶液，使原生质体浮于溶液的表面的，这种 方法可以收集较纯的原生质体
8、，但原生质体 数量上损失较多，也往往因采用高渗溶液而 对原生质体有害。 界面法：利用两种比重不同的溶液，使健康和 完整的原生质体处于两液相的界面之中，这 种方法能使细胞碎片和细胞器逐渐清除，并 可获得更纯净的原生质体。 6、原生质体的活力鉴定 1）细胞壁染色法：荧光增白剂对植物细胞壁是 一种最优越的染料。不仅可鉴定细胞壁是否 完全除尽，而且可检查原生质体培养过程中 壁的再生。细胞壁与染料形成显眼的绿色荧 光，没有细胞壁的则无荧光反应，略带红色 。 2）原生质体活性鉴定：短时间内测定活力有多 种方法，如观察胞质环流作为旺盛代谢指标 、Evans蓝活性染色、测定光合活性、用氧电 极法测定氧呼吸、用
9、荧光素双醋酸酯（FDA） 等。 二）原生质体培养 1、培养基 原生质体培养与组织及细胞培养类同，原生质体与 细胞的主要差别是除去了细胞壁，所用培养基一般是加 以改良的培养基， 如KM8p和K8p培养基是以B5培养基为基础，NT培养基 则以MS培养基为基础。 禾谷类植物的原生质体培养基多数是以MS、Du、N6、 KM、AA为基本培养基。 十字花科和豆科植物则多数以B5、KM8p、K8p、KM为 基本培养基， 茄科植物以MS、NT、K3为基本培养基。 原生质体培养基中需有一定浓度的渗透压稳定剂 2、培养方法 固体培养 液体培养 固液结合培养 念珠培养 看护培养 A、固体培养法（平板法）： 将纯化后
10、悬浮在液体培养基中的原生质体悬浮 液与热融并冷至45的含琼脂或琼脂糖或Gelrite的 培养基等量混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀 分布于培养基中，待凝结后，将容器倒置于四周垫有 保湿纸或含水海绵的培养皿内，封口。由于原生质体 被彼此分开并固定了位置，这种方法避免了细胞间有 害代谢产物的影响，并便于定点观察，有利于追踪单 个原生质体再生细胞壁的发育过程。 B、液体培养法： 将原生质体悬浮在液体培养基中。 最常用的是液体浅层培养法和悬滴 培养法。 C、固液结合培养法： 最为简便的固液结合培养法为双层培养法，即 在培养皿的底部先铺一薄层含琼脂或琼脂糖或 Gelrite固体培养基（含或包含原生质
11、体或细胞）， 再在其上进行印刷体的液体浅层培养。这种培养方式 有利于固体培养基中的营养成分（或细胞代谢物）可 以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的消耗 ，同时培养物所产生的一些有害物质，可被固体部分 吸收，对培养物生长更有利。 念珠培养法： Shillito等建立了一种“念珠培养 法”，将含有原生质体的琼脂糖培养基 切成块放到大体积的液体培养基中，并 在旋转摇床上振荡以利于通气。使用大 体积的液体是为了防止琼脂糖块过度破 碎。 看护培养法： 看护培养法是固液双层法的引申。将水 稻或玉米悬浮细胞包埋于琼脂或琼脂糖的培 养基中，在其上铺聚脂纤维或硝酸微孔滤膜 ，将含水稻或玉米原生质的液体培养
12、基置于 其上进行培养。采用看护培养法在水稻和玉 米中，都证明看护细胞有促进原生质体生长 和细胞分裂的作用。 3、培养条件 原生质体培养前的热激处理和超低温处理可提高原生质 体植板率。 去除细胞壁的原生质体，在培养初期极其脆弱，由于光 、温、湿度等条件的不适往往会引起培养基成分及渗 透压的变化，影响原生质体正常生长发育。 一般对于叶肉、子叶、下胚轴等带有叶绿体的原生质体 ，在培养初期最好置于弱光或漫射光下，由愈伤组织 和悬浮细胞脱壁的原生质体应避免光照置于暗中培养 。 培养温度一般为2530，随种而异。 二、 由原生质体再生植株 分离的植物原生质体在合适的培养条件下，可以再 生形成植株。 197
13、1年首次由烟草叶肉原生质体培养再生植株成 功后，现通过原生质体培养形成芽或胚状体，进而再生 植株的植物种类已达367种，分布于46科，160属，成功 的种最多的是茄科，随后依次为豆科、禾本科、菊科、 十字花科、伞形科和蔷薇科。 1、原生质体培养中的再生过程 由植物原生质体培养再生完整植 株，经历了由细胞壁的再生、细胞 分裂、细胞团和愈伤组织的形成以 及植株再生等几个不同的阶段。 2、原生质体再生植株形成的途径 1） 器官形成途径： （1）原生质体培养基 （2）分化培养基 （3）生根培养基 2）、胚胎发生途径： 通过胚胎发生途径再生植株的植 物种类，多集中在禾本科、伞形科 、芸香科、葫芦科和豆科
14、中，还有 裸子植物的松科。 3、原生质体再生植株的遗传特性 原生质体再生植株往往在形态和性状方面出现 变异，如出现白化苗、“玻璃苗”、叶发生变异、性 别、育性及发育期等发生变异。除形态和性状发生 变异外，染色体的倍性和数目也常常发生变化。造 成变异的原因是多方面的，一种是分离原生质体的 材料本身所存在的，这在使用长期无性繁殖的植物 材料时更易发生。另一方面更重要的原因可能在于 原生质体操作本身引起的。 原生质体分离 原生质体纯化 原生质体培养 胞壁再生 细胞分裂形成细胞团 再生植株 小结 第二节 原生质体融合和细胞杂交 细胞融合（细胞杂交） 两种异源（种、属间）原生质体 ，在诱导剂诱发下相互接
15、触，从而发生 膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种 细胞，进一步发育成杂种植物体，称为 细胞融合或细胞杂交。 一、细胞融合的类型 第一类最常用的即体细胞杂交，用双亲的体细胞原生 质体或其衍生系统进行诱导融合，再经培养、筛选 、鉴定等步骤得到细胞杂种； 第二类是配子间细胞杂交，即用双亲的性细胞原生质 体为融合亲本，其他步骤同第一类； 第三类是配子体细胞杂交，即一个融合亲本为性细 胞原生质体，另一个为体细胞原生质体。目前工作 仍以体细胞杂交为多，其他两类开始有些报道 1、体细胞杂交 常规细胞杂交是用双亲脱去细胞壁的原生质体来 进行的，经诱导融合、筛选和鉴定，然后得到细胞杂 种。 由于原生质体具有各自
16、亲本的全部遗传信息，如 果杂交组合是近缘而亲和的，则通过细胞杂交可以得 到具有双亲所有遗传信息的细胞杂种，他们是对称的 细胞杂种。 双亲都是二倍体原生质体则可以得到双二倍体 ，双亲都是单倍体的可以得到双单倍体。 细胞融合的过程 膜融合 胞质融合 核融合 (1) (1) (2) (3) (4) (5) 植物体细胞杂交 过程示意图过程示意图 2、不对称细胞杂交 除了用双亲完整的原生质进行诱导融合外，也 有用一个亲本的原生质体与另一亲本原生质 体的衍生系统 如： 原生质体与胞质体 原生质体与核质体 甘蓝白化苗下胚轴胞质体和甘蓝型油菜原生 质体诱导融合得到胞质杂种。 3、 体细胞与性细胞杂交 性细胞原生质体融合以及体细胞原生质 与性细胞原生质体融合，早已引起人们的注 意。但由于性细胞原生质体的制备和培养存 在技术上的问题，这方面的进展十分缓慢。 近年来，由于制备分离精细胞原生质体与卵 细胞原生质体取得成功，使在离体培养条件 下探索受精作用有了可喜结果。 4、 微细胞杂交 在哺乳动物和人类的细胞生物学或细胞工程研究 中，常采用微细胞杂交（microcell hybri
