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1、华中科技大学 博士学位论文 氧化苦参碱干预大鼠阴茎海绵体纤维化作用机制的实验研究 姓名：樊龙昌 申请学位级别：博士 专业：外科学（泌尿外科） 指导教师：刘继红 20070501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 氧化苦参碱干预大鼠阴茎海绵体纤维化氧化苦参碱干预大鼠阴茎海绵体纤维化 作用机制的实验研究作用机制的实验研究 博士研究生：樊龙昌 导 师：刘继红 教授 华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科 湖北 武汉，430030 中中 文文 摘摘 要要 阴茎海绵体纤维化疾病如阴茎硬结症(Peyronies disease)可导致海
2、绵体勃起组织 中平滑肌和结缔组织比例失衡，同时损害白膜的容韧性，造成勃起时出现阴茎弯曲和 不同程度的性功能障碍，甚至不能勃起。目前具体病因及发病机制不明，尚无实用的 动物模型和有效的治疗手段。转化生长因子-1(transforming growth factor-1, TGF-1) 在阴茎海绵体纤维化中扮演着非常重要的角色。注射外源性 TGF-1，可促进阴茎海 绵体和白膜纤维化。但外源性生长因子纯化过程复杂，价格昂贵，半衰期短，需大剂 量反复使用，因而限制了其应用。随着分子生物学的发展，使人们可利用转基因技术 将编码生长因子的基因导入细胞，其优点是转基因细胞可在局部持续表达高生物活性 的内源性
3、生长因子，调控其自身增殖分化，而且其表达产物经过翻译后修饰过程，可 更有效地与靶细胞表面受体结合，获得最佳效应所需要的剂量大大地减少。 本实验拟将构建真核表达载体重组质粒 pcDNA3.1(+)-hTGF-1，采用脂质体转染 阴茎海绵体组织诱导其纤维化，建立大鼠阴茎海绵体纤维化的动物模型。中药氧化苦 参碱对器官纤维化疾病具有良好效果，但国内外尚未见报道其在防治阴茎海绵体纤维 化中的作用。本文在建模的基础上，将进一步研究中药氧化苦参碱防治阴茎海绵体纤 维化的作用机制。 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 第一部分第一部分 人转化生长
4、因子人转化生长因子-1(hTGF-1)基因基因 真核表达载体的构建真核表达载体的构建 目的：目的：构建人转化生长因子-1 基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+)-hTGF-1。 方法：方法：对质粒 pcDNA3.1(+)和 pAdlox-hTGF-1 进行双酶切、胶回收、连接、转 化、筛选等基因克隆方法，构建 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 真核表达载体。采用双酶切鉴 定、PCR 扩增目的基因片段，并进行基因测序。 结果结果：双酶切、PCR 扩增及基因测序结果显示，所构建的真核表达载体中含有 hTGF-1 基因与预期的目的基因一致。 结论：结论：成功构建 pcDNA3.1(+)-hT
5、GF-1 真核表达载体。 【关键词关键词】转化生长因子 1；基因克隆；PCR；基因测序 第二部分第二部分 人转化生长因子人转化生长因子-1(hTGF-1)基因在基因在 阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达 目的：目的： 研究人转化生长因子-1 基因真核表达载体 pcDNA3.1(+) -hTGF-1 在 SD 大 鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth cells, CCSMCs)中的表达。 方法：方法：采用组织块培养法原代培养 SD 大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞；脂质体转染 方法将基因克隆构建的 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 真核表达
6、载体转染 SD 大鼠 CCSMCs， G418 筛选获得稳定转染的细胞；MTT 法检测其增殖活性，FCM 检测细胞凋亡， RT-PCR、ELISA、Western blot 和免疫细胞化学检测其表达效率。 结果结果： pcDNA3.1(+)-hTGF-1 能在真核细胞 CCSMCs 中成功表达， 转染效率可达 4050%；RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实，hTGF-1 基因在 CCSMCs 中至少可 持续表达 4w，细胞浆内及细胞外基质中 hTGF-1 mRNA 及蛋白水平均增加；MTT、 FCM 检测提示转染 hTGF-1 基因可促进 CCSMCs 增殖，未见细胞凋亡发生。 结论：
7、结论：重组质粒 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 在 CCSMCs 中可持续稳定表达 hTGF-1， 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 具有促细胞增殖的作用。 【关键词关键词】阴茎海绵体平滑肌细胞；转化生长因子-1；基因转染 第三部分第三部分 阴茎海绵体纤维化动物模型的建立阴茎海绵体纤维化动物模型的建立 目的：目的：转化生长因子-1(TGF-1)已经证实在阴茎海绵体纤维化中扮演重要的角 色，最终导致勃起功能障碍。本研究目的是为建立阴茎海绵体纤维化的有效的动物模 型，进一步阐明 TGF-1 信号通路与海绵体纤维化的联系。 方法
8、：方法：采用脂质体转染法将 hTGF-1 基因导入雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠的 阴茎海绵体内，以制作纤维化模型。将 36 只大鼠随机分成 3 组：对照组 pcDNA3.1(+) 组、 造模组 rhTGF-1 组(注射重组人 TGF-1 200ng/0.1ml3d)和 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 组。应用 RT-PCR 检测海绵体纤维化动物模型的海绵体组织中 hTGF-1、CTGF 及 FN mRNA 的表达；免疫组织化学方法检测 hTGF-1 蛋白在海绵体组织内的表达和分布； HE 染色、苦味酸天狼星红偏振光法对海绵体组织中纤维化病变、胶原的性质及分 布特点进行
9、观察；罂粟碱诱导勃起下阴茎海绵体内测压(ICP)检测动物模型的勃起功 能。 结果：结果： RT-PCR 显示， 转染 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 组 hTGF-1 mRNA 表达可持续 至注射后 4w。免疫组织化学方法可见转染后不同时期 hTGF-1 在海绵体组织内均有 不同程度的表达。苦味酸天狼星红染色和偏振光法可确定海绵体纤维化组织胶原类 型、分布、排列与含量。偏振光显微镜下可见，转染 pcDNA3.1(+)-hTGF-1 组注射 4w 后在海绵体组织内出现大量纤维化，与 rhTGF-1 组造模效果相同，而转染 pcDNA3.1(+)组未见纤维化的组织学证据。随海绵体纤维化程度的
10、不同清晰地显示嗜 酸性胶原蛋白纤维束，其中型胶原纤维(Col ) 为粗大明亮的黄或红色纤维，显示 很强的双折光性；型胶原纤维(Col ) 为绿色细纤维，呈疏网状，显示弱的双折光。 经图像分析，pcDNA3.1(+)-hTGF-1 组 14 天时 Col 占(10.582.33)%，Col 占 (45.132.67)%；28 天时 Col 占(50.122.58)%，Col 占(38.141.66)%。罂粟碱诱导 勃起时，阴茎海绵体内测压(ICP)显示，pcDNA3.1(+)-hTGF-1 组的最大海绵体内压 (MAP)显著低于另外两组。 结论：结论：转染 pcDNA3.1(+)-hTGF-1
11、可有效地造成大鼠阴茎海绵体纤维化。这一新 型的动物模型的建立能够更进一步明确阴茎海绵体纤维化的病理进程与 TGF-1 信号 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 通路的关系，并从该信号通路中寻求新的治疗手段。 【关键词关键词】海绵体纤维化；hTGF-1；大鼠，动物模型 第四部分第四部分 氧化苦参碱干预阴茎海绵体纤维氧化苦参碱干预阴茎海绵体纤维 化疾病的实验研究化疾病的实验研究 目的：目的：观察氧化苦参碱(Oxymatrine, OM)防治大鼠阴茎海绵体纤维化的疗效并探 讨其作用机制。 方法：方法：采用第三部分实验方法建立大鼠阴茎海绵
12、体纤维化模型，观察氧化苦参碱 (30mg/kg、90mg/kg)、地塞米松(1mg/kg)干预建模前后，TGF-1、CTGF、FN mRNA 和蛋白表达水平、大鼠阴茎海绵体病理组织学和胶原变化以及勃起功能的改变。 结果：结果：氧化苦参碱干预组较模型组 TGF-1、CTGF、FN 表达水平明显降低；苦 味酸天狼星红染色显示海绵体内胶原蛋白含量下降；病理组织学检测显示海绵体纤 维化程度降低；ICP 显示干预组勃起功能有所改善，但低于地塞米松组。 结论：结论：氧化苦参碱对 hTGF-1 诱导的阴茎海绵体纤维化有预防作用，其可能机制 为通过抑制 TGF 及其下游因子的启动和表达，从而抑制胶原纤维的生成
13、。 【关键词关键词】氧化苦参碱；海绵体纤维化；TGF-1；大鼠 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 5 An experimental study of prophylactic and therapeutic effects of Oxymatrine on rat corpus cavernosum fibrosis induced by hTGF-1 gene Doctoral Candidate: Fan Long-Chang Tutor: Prof. Liu Ji-Hong Department of Urology Ton
14、gji Hospital, Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology Wuhan, 430030 Abstract Part The Construction of Eukaryotic Vector Carrying Human Transforming Growth Factor 1 (hTGF-1) Gene Objectives: To establish an efficient and reliable method of constructing, purifying and prop
15、agating the recombinant eukaryotic vectors pcDNA3.1(+)-hTGF-1. Through the study of construction of replication-deficient recombinant vector coding for hTGF-1 gene, we could transfect it into corpus cavernosum smooth cells and let it last to express hTGF-1 in these cells. Methods: Recombining DNA an
16、d gene clone technique were applied to construct recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-hTGF-1 which contains human transforming growth factor 1 gene. The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-hTGF-1 were extracted and then 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 6 detected elementarily the positive cloning gene via single enzyme and double enzyme digestion. We used the method of PCR to expand hTGF-1 target gene
