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1、某市水源水中有机提取物韵类雌激素作用研究 王霞张宇洁蒋颂辉张国州殷丽红朱惠刚屈卫东 ( 复旦大学公共卫生学院环境卫生学教研室上海 2 0 0 0 3 2 ) 摘要为研究水中有机提取物的类雌激素活性采用出生17 天的I C R 雌鼠做子宫增重实验。比较子宫湿重 变化。观察H E 染色组织切片中子宫上皮细胞高度和腺体数目并应用免疫组化A B C 法检测增殖细胞核抗原 ( P r o l i f e r a t i n gC e l lN u c l e a rA n t i g e n P C N A ) 的表达。结果发现：各粥组阊子宫湿重瓤腺体数且的变化不明 显。但上皮细胞高度随剂量增高有较为明
2、显的增高。P C N A 在阳性对照及高翔量缉表达明显，低剂量维及阴性对 照表达不明显或无表达。提示：本研究检测水样可能具有雌激素活性。 关键字：子宫增重内分泌干扰物P C N A类雌激素作用 按照美国环保局“内分泌干扰物甄别与测试委员会”的定义，内分泌干扰物( e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s e n d o c r i n ed i s r u p t o r s ，E D C s E D s ) 是指能改变机体内分泌功能并对机体、后 代或( 亚) 群引起有害效应的外源性物质。由于绝大部分的E D C s 具有干扰雌
3、激素的作用，故有 学者将这些具有干扰雌激素作用的化学物称为环境雌激素( E n v i r o n m e n t a lE s t r o g e n s ，E E s ) 。 一般来说，人体暴露于内分泌干扰物质的途径除了食品的直接摄取以外，另一个重要的途径是来 自于水的摄取。 随着工农业的不断发展，人口的持续增长，大量的E DS 入水，水质受到越来越严重的污 染。这些有害物质被人和动物通过饮水摄入体内，通过各种作用方式，包括干扰激素的合成和 代谢，模拟内源性激素作用等来影响机体的正常代谢、生殖、发育等功能。近年来人类精子数 量下降、某些水生动物发生性别畸形及隐睾、尿道下裂等疾病发生率上升，
4、推测可能就是环境中 的这些化学物质所致。因此，水中有机提取物内分泌干扰活性的检测和研究是十分必要和迫 切的。 本次实验利用子宫增重实验，H E 染色组织切片中子宫上皮细胞高度和腺体数目的变化，及免 疫组化A B C 法检测增殖细胞核抗原( P r o l i f e r a t i n gC e l lN u c l e a rA n t i g e n ，P C N A ) 的表达，研究 菜市水源水中有机提取物的类雌激素作用。 1 材料与方法 1 1 实验动物 出生1 7 天的I C R 雌鼠( 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供) 。 1 2 实验试剂 17D 一雌二醇( 17 目一e
5、s t r a d i o l ，E 2 ，S i g m a ) 、市售玉米油、a n t i P C N Am o u s em o n o c l o n a l a n t i b o d y ( Z Y M E D ) 、A B C 试剂盒( 华美生物工程有限公司) 、小牛血清白蛋白( B S A ，S i g m a ) 、 3 , 3 一d i a m i n o b e n z i d i n e ( D A B ，A m r e s c o ) 1 3 实验方法 第一作者王霞，复旦大学环境毒理学专业硕士研究生。 基金项目：国家高科技研究发展计划8 6 3 专项金费支助( N
6、o 2 0 0 2 A A 6 0 l l3 0 ) 。 1 0 4 - - 1 3 1 水样的采集与处理于某市采集源水水样1 2 0 升，经装有6 克4 0 2 树脂和2 克X A D 一2 的 玻璃柱( 2 5 c mx1 1 5 c m ) 过滤吸附有机物，过柱前树脂需用有机溶剂清洗干净。吸附在树脂上的有 机物用4 0 m l3 0 甲醇一丙酮洗脱液洗脱，洗脱液置4 5 水浴挥于后，用1 0 0 甲醇再溶，定容至6 m l ， 待用。 1 3 2 子宫增重实验 l7 天断奶I C R 雌性小鼠完全随机分组，每组5 只。以玉米油为溶剂对照， 水为空白对照，1 7 目一雌二醇溶于玉米油( 1
7、 0 0l a g k g d ，1 0l a g k g d ) 为阳性对照。有机提取物同样 以玉米油为溶剂，设立5 个剂量组，分别相当于人饮水量8 L d ，4 L d ，2L d ，l L d ，0 5 L d 所含有机 物。各受试物剂量组及对照组自l7 天开始经颈背部皮下注射染毒。每天一次，连续三天( 17 、 18 、l9 天) 。第四天( 2 0 天) 早上，颈椎脱臼处死小鼠，记录体重，解剖分离子宫。分离子育时 注意不要让子宫腔内所含液体流出，因为液体也是雌激素作用后产生的反应结果。子宫上端从与 输卵管交接处切断，子宫颈自阴道穹隆处切断，去除脂肪及系膜，立即称重。放入B o u i
8、 n S 固定液 固定2 4 小时后，每组取2 个子宫，石蜡包埋，经H E 染色进行组织学观察。每个子宫取子宫角中 段，左边子宫角做成4v m 厚纵切片，观察上皮细胞高度；右边子宫角做成4v m 厚纵切片，观察 腺体增生情况。 1 3 3 子宫湿重测定分离子宫，称重，计算子宫重量与小鼠体重之比。采用S P S S 统计软件运用 单因素方差分析进行统计学检验( 仅= 0 0 5 ) 。 1 3 4 上皮细胞高度子宫增重实验标本石蜡包埋，制成4 ”m 厚纵切片。经H E 染色，用显微镜 观察上皮细胞高度并作比较。 1 3 5 腺体数目子宫增重实验标本石蜡包埋，制成4u m 厚横切片。经H E 染色
9、，用显微镜观察 腺体增生情况并作比较。 1 3 6P C N A 细胞增殖实验受试物各剂量组与对照组在小鼠出生后第1 7 天皮下注射一次，第1 8 天解剖分离子宫，因为P C N A 在雌激素作用后18 个小时可以产生最佳效果。分离的子宫放入 10 福尔马林中性缓冲液( 4 ) 固定，第二天转入7 0 乙醇( 4 ) 。石蜡包埋，以子宫角中段 分别制成4v m 厚横切片及纵切片。石蜡切片经常规脱蜡，水化。微波修复抗原，新鲜配置3 双 氧水1 0 m i n 以减少内源性过氧化物酶活性；以P B S 配制1 牛血清白蛋白湿盒孵育1 5 m i n 以降低 背景染色；吸干，P C N A 抗体(
10、1 ：l0 0 ) 37 湿盒孵育3 0 m i n ；P B S 冲洗，生物索标记二抗 ( 1 ：5 0 ) 3 7 湿盒孵育3 0 m i n ；P B S 冲洗后以A B 复合物( 1 ：5 0 ) 3 7 湿盒孵育3 0 m i n 。P B S 冲洗，以D A B 显色液室温反应1 2 m i n ，镜下控制显色。P B S 冲洗后，苏木精复染，脱水，封片， 镜下观察。 2 结果 2 1 子宫湿重 各组经皮下染毒，生长良好，无一死亡，体重均有不同程度的增加。经S P S S 单因素方差分 析，受试物各剂量组与溶剂对照相比子宫湿重无统计学差异。各组之间也无显著性差异( 表1 ) 。 子
11、宫重量系数经分析各剂量组与阴性对照相比亦无统计学差异( 表1 ) 。 2 2 上皮细胞高度 H E 染色照片( 图1 ) 可以比较清晰的看到上皮细胞的增生情况。阴性对照的上皮高度较低， 相应的阳性X 寸照的上皮纽瞧高度增高相当明显。丽高裁萋组上皮缨胞高度介于两者之间，提示此 次所测水样中有机提取物的类雌激素样活性。 2 3 腺体数目 图2 显示腺体数目在各剂量组差异不是很大，高剂量组无显著增生，统计学上无显著性差异。 - 1 0 5 - - 表1受试物对实验动物子富瀣t 的影响 受试物 体重( g )子宫湿重( g ) 子宫重量系数 洼：产官重赣系数：子宫重量小鼠体重1 0 0：与阴性对照(
12、玉米油及水) 比较p O 0 5 ( 1 ) 1 7 d 一雌二醇( 1 0 0 l a g k g d ) ( 2 ) 阴性对照( 3 ) 4 L d 剂嚣组 强1受试物对实验动物子宫上皮细胞赢度的影响( H E ，x4 0 0 ) 一1 0 6 一 受试物( L O ) E 2 ：17 8 雌二醇( 1 0 0 “g k g d ) 豳2受试物对实验动期子宫腺体数目的影响 ( i ) 1 70 一雌二醇( 1 0 0 “g k g d )( 2 ) 玉米渣组 玉米油 加 b ， O 血燕蛏鹭 ( 3 ) 4 L d 剂量组( 4 ) 2 L d 荆量组( 5 ) lL d 剂量组 圈3受试
13、物对子宫P C N A 表达的影响( I H C 4 0 0 ) 2 4P C N A 表达 由图3 可见，P C N A 的表达在阳性对照组十分强烈，高剂量组与阴性对照也有较明显的 差异。 3 讨论 化学物的雌激索活性不能靠它的化学结构来确定，目前环境雌激素的检测方法很多，各有优缺 点。体外试验检测环境雌激素活性虽然灵敏、经济、快速，且能够提供有关作用机理方面的信息， 但不能观察到体内代谢活化、相互作用及生物蓄积效应等影响。所以，要对环境雌激素进行比较全 面的雌激素活性评价，进行体内试验是非常必要的。一般将体外试验作为环境雌激素的初步评价过 程，最终确定是否具有雌激素活性还要进行体内试验。
14、参考文献( 略) ( 上接第1 0 3 页) 素) 可通过自由基等引起肺巨噬细胞、上皮细胞损伤，释放炎性介质和T N F 一0 【、I L 一1 、I L 一6 等 细胞因子，引起肺损伤症状。N O ：吸入则可引起肺泡表面活性物质的过氧化，损害细支气管的纤 毛上皮细胞和肺泡细胞，破坏肺泡组织的胶原纤维；N O ：亦可以缓慢地溶于肺泡表碾的水分中， 形成亚硝酸、硝酸，对肺组织产生强烈的刺激及腐蚀作用。这些都可以部分解释S A R S 病人对大 气P M 。、N O ：污染的易感性。与此同时，本文并未观察到S O ：对S A R S 病死率的影响，我们推测 这可能与该时间段内S O z 浓度相对较
15、低( 平均3 4 3t a g m 3 ，见表1 ，符合国家一级环境空气质量标 准) 、以及S 0 ：易溶于水故主要影响上呼吸道相关。 我们对国内S A R S 病死率的地区间比较也表明，大气污染相对严重的地区，如北京、内蒙等， 其病死率也相对较高( 分别为7 6 、9 9 ) ；大气污染相对轻微的地区，如广东，其病死率也相 对较低( 为3 8 ) 5 。这种地区间的生态学比较，虽然存在较多的混杂因素，可信度较低；但却从 另一角度提醒我们有必要研究S A R S 病死率的波动变化与大气污染的关系。 总之，本研究结果提示S A R S 患者病死率的波动可能与大气污染有关。当然，相关并不代表 两者存在因果关系，后者结论的得出尚需更多流行病学研究在不同的地区加以证实。同时，目前 我国各地采取了很多环境和能源政策，大气污染状况较前有了很大提高。我们的研究结果还提示， 这些政策的实施，不仅可以改善当地的大气污染状况，而且可能对降低S A R S 一类的生物性传染 性疾病病死率有一定作用。 参考文献( 略) - 1 0 7 - -
