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1、毛细管电泳激光诱导荧光检测测定脑啡肽方法的建立军事医学科学院国家生物医学分析中心董标董方霆梁月琴吴胜明脑啡肽是阿片肽的一种存在于哺乳动物的组织和体液中作用极为广泛具有镇痛抑制呼吸和参与应激反应等功能1尽管阿片肽研究取得一定的进展但阿片肽体内作用机制十分复杂一些临床和药理方面的机理还是未知为了更好理解阿片肽的生理作用和治疗方法的相关性必须准确测定生物组织和体液中的痕量的内源性阿片肽放射免疫分析RadioimmunoassayRIA是定量测定阿片肽的灵敏方法其缺点是一个抗体和其它肽的交叉免疫反应限制了分子的专一性其次放免试剂盒的成本较高一种放免试剂盒只能测定其中一种阿片肽操作复杂费时使用时接触有生
2、物毒性的放射性物质如125I易对人体造成损害毛细管电泳是上世纪80年代初迅速发展起来的一门分离分析技术具有高效快速灵敏样品用量少等特点在生命科学环境科学食品科学临床等领域有着广泛的应用2-3毛细管电泳的分离模式众多分离机理也各不相同对样品来源受到限制的少量体积样品如微透析液分析毛细管电泳-激光诱导荧光检测CE-LIF已成为首选技术为了开辟阿片肽定量的新途径对生物样品中微量的阿片肽能同时测定我们以阿片肽的标准品脑啡肽强啡肽-内啡肽为分离目标采用CE-LIF毛细管电泳技术对此进行探索一实验部分1.1仪器与试剂PACE5000型毛细管电泳仪Beckman公司美国配有紫外检测器和氩离子激光诱导荧光检测
3、器ex=488nmem=513nm质谱仪为电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2英国micromass公司亮氨酸脑啡肽Leu-ENK纯度99%含量79%强啡肽ADYNA纯度99%含量72%-内啡肽-EP纯度99%含量77%均购自sigma公司荧光素异硫氰酸盐FITC异构体三羟基甲基氨基甲烷Tris十二烷基硫酸钠SDS为进口分装其余试剂均为国产分析纯1.2标准品溶液的配制精密称取一定量的阿片肽标准品用去离子水溶解配成浓度为1.0mgmL的储备液放-20保存临用前稀释到所需的浓度微透析液每次取5L未作任何处理直接进行衍生化分析1.3样品的衍生化过程所有衍生化过程都在200L具塞离心管中进行取一定
4、量的样品液和0.2molLpH9.0碳酸钠盐缓冲液衍生化时加入一定量的FITC溶液0.2mgmL乙腈溶解含1%甲醇0.25吡啶vv涡旋混匀后避光室温反应12-14h空白对照按相同方法配制每次样品衍生化时均同时制备空白对照二结果与讨论2.1分离模式的选择PACE5000型毛细管电泳仪配有紫外检测器和激光诱导荧光LIF检测器由于紫外检测器的通用性对于蛋白质肽类样品不需要任何处理即可检测我们首先用紫外检测方法对阿片肽标准品进行分离采用MEKC的分离模式对阿片肽标准品分别进样分离仅Leu-ENK脑啡肽出现色谱峰采用CZE分离Leu-ENK-EPDYNA在不同的保留时间出峰混合后进样三者能完全分开在相同
5、进样量情况下Leu-ENK色谱峰的吸收强度约是MECC分离时的色谱峰强度的10多倍故此确定CZE为分离模式配制一系列不同浓度的阿片肽标准混合液进行分离阿片肽的紫外最小检测限约为210-12molL文献报道用RIA测定脑组织中内源性阿片肽的浓度仅为pgmg的水平紫外检测的灵敏度远低于实际样品的含量LIF检测是CE所有检测方法中灵敏度最高的一种方法但是大多数物质的荧光量子产率很低或不发荧光特别是感兴趣的一些生物大分子如氨基酸多肽和多数蛋白质等因此需借助衍生或荧光标记技术使待测组分转变为能发荧光的衍生物提高检测灵敏度不同的荧光试剂有不同的激发和发射波长标记的对象也不尽相同恰当地选择激发波长和荧光标记
6、试剂对提高检测灵敏度有着重要意义PACE5000型毛细管电泳仪配备的LIF检测器其exem为固定波长488520nm最适合的荧光衍生试剂为FITC2.2样品衍生化条件的优化FITC用于标记胺氨基酸抗体等衍生化条件已有很多研究6-8用于多肽的衍生化还未见文献报道为了达到最佳的检测灵敏度和分离效率对柱前衍生条件进行优化是必需的影响衍生化的因素很多有反应时间pH缓冲液等我们以Leu-ENK为对象对这些因素考察文献中溶解FITC的溶剂有丙酮乙腈甲醇经比较发现用乙腈作溶剂时分离色谱图上FITC副产物的峰少FITC-ENK色谱峰的荧光强度与丙酮甲醇作溶剂时相近故选择乙腈作为FITC的溶剂FITC衍生化的过
7、程不快随着标记化合物的不同文献上报道的反应时间也不同衍生化时微量吡啶的存在会加速反应完成且起到稳定衍生化产物的作用5因此配制FITC溶液时加入痕量的吡啶考察了2h4h8h12h16h不同时间点的衍生化程度发现在12h反应已完全在实验时采取衍生化反应12-14h比较pH9.0碳酸钠盐CB缓冲液和pH9.0的硼砂缓冲液对衍生化效率的影响二者结果相近在优化的衍生条件下对阿片肽的标准品Leu-ENK-EPDYNA分别进行CZE-LIF分析脑啡肽的FITC-ENK为一单峰而-EP和DYN均为多个色谱峰可能是多重标记造成的9故强啡肽和-内啡肽不适宜用FITC进行衍生化测定无法对-EP和DYN进行定量分析2
8、.3分离条件的优化电动进样与样品溶液的离子强度和各组分的淌度有关存在电歧视现象故均采用最常用的压力进样方式电泳分离效果的指标主要是标记的FITC-ENK峰与FITC及其降解产物色谱峰的分离情况比较了不同毛细管长度475767cm和内径5075m的分离情况毛细管柱长分离度好出峰时间延长在毛细管柱长度相同的情况下50m内径柱分离好于75m但由于载样量小检测限低于后者近一个数量级故我们选择的毛细管柱为75m67cm考察Tris-硼砂缓冲液不同浓度20406080mmolL的分离效果60mmolL分析效果最好电泳缓冲液的浓度太低不仅样品区带会发生电扩散而且电渗流EOF的速度过快降低FITC衍生物的有效
9、淌度差异从而降低分离效率随着缓冲液的浓度增加电渗流速度降低溶质在毛细管内的迁移速率下降因此迁移时间延长但浓度太高产生的焦耳热的增加也会降低分辨率和分离效率缓冲液pH是又一影响电泳分离的重要因素比较pH为8.69.09.49.810.0缓冲液的分离结果选择pH9.4的Tris-硼砂缓冲液2.4工作曲线的建立取Leu-ENK储备液用水稀释配制一系列不同浓度gmL0.050.080.100.200.400.801.00的Leu-ENK标准液各取80L按1.3项下方法操作加入40L的FITC和40L碳酸盐缓冲液衍生化后进行CZE-LIF分析以峰面积A对其相应的浓度CfmolL进行回归分析结果见图1得到
10、回归方程A=0.49466+0.08592Cr=0.9985n=7以3倍信噪比计算检出限得到ENK检测限为1.610-15molL电泳图见图1连续进样5次来考察所建立电泳方法的重复性色谱峰面积和保留时间的相对标准偏差RSD分别为10.36%和0.72%色谱峰面积的RSD较大部分原因是衍生化后样品中含有易挥发的溶剂乙腈一段时间后由于乙腈的挥发样品的体积变小浓度相对变大所致文献中报道CE-LIF的浓度检测限达10-15molL水平是在样品浓度过高的情况下对FITC进行衍生化然后再逐级稀释到所需浓度不涉及实际微量样品的分析测定这种条件下得到的检测限实际上只反映了LIF检测器的检测灵敏度并不能真实反映
11、整个分析方法的检测限用建立的方法对实际样品进行测定测得微透析液中ENK的含量为7.410-15molL见图22.5串联质谱法测定阿片肽我们还尝试建立串联质谱Q-TOF测定阿片肽方法根据质谱峰强度来定量配制一系列不同浓度的阿片肽标准品进行测定检出限为510-14molL另外由于影响质谱峰离子流的强度因素很多用其定量较为困难三结论CE用于神经肽方面的研究已有不少报道10-13其中Frts-MateiA.等1113用MEKC分离合成的强啡肽脑啡肽及其类似物我们研究的最初目的是建立CZE-LIF方法分离测定脑啡肽强啡肽内CFITCAB荧光相对强度minminminFITC-ENKFITC-ENKFIT
12、C-ENKDmin图1CZE-LIF分离FITC衍生化的脑啡肽标准品电泳图A空白对照BENK标准品35.2fmolL.CENK标准品70.4fmolLDENK标准品140.8fmolL分离条件75m67cm60mmolLpH9.4Tris-硼砂缓冲液电压350kvcmLIF检测exem488520nm柱温25压力进样2sBAFITC-ENKFITC-ENK图2实际样品测定的CZE-LIF图A脑啡肽标准品B微透析液分离条件75m67cm60mmolLpH9.4Tris-硼砂缓冲液电压350kvcmLIF检测exem488520nm柱温25压力进样3s啡肽三种物质由于强啡肽内啡肽产生多重标记峰无法
13、进行定量分析故仅对脑啡肽进行进行测定我们用毛细管电泳技术对阿片肽定量进行摸索建立CZE-LIF测定Leu-ENK的方法并测定了微透析液中脑啡肽的含量这对于研究脑啡肽的作用机制具有一定的现实意义建立的CZE-LIF测定ENK的方法还需要在实际应用中进一步完善参考文献1.OlsonG.A.OlsonR.D.KastinA.J.peptides1419931339-13782.林炳承著毛细管电泳导论北京科学出版社1996180-2433.邓延倬何金兰编著高效毛细管电泳北京科学出版社1996285-3334.HernandezL.TucciS.GuzmanNetalJ.Chromatogr.A1993
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