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1、枇杷LFY、APl同源基因的克隆及表达研究刘月学林顺权胡桂兵(华南农业大学园艺生物技术研究所广州五山510642)本研究从枇杷成花的基础方面入手，进行了枇杷成花相关基因的克隆、表达分析研究和功能验证的初步探索。本研究主要结果如下：1、针对枇杷材料(叶片、叶芽、花芽等)大多都覆盖有茸毛、材料富含酚类等次生物质的特点，对枇杷核酸的提取进行了改良研究，提出了适合枇杷材料的核酸提取方法。其中，DNA的提取关键是加蛋白酶K以及其它因素的配合；RNA的提取关键是多次抽提加LiCI沉淀，利用这些方法所提取的枇杷DNA和RNA质量较高，能够满足一般分子生物学实验的要求。2、对枇杷成花相关基因ejLFY进行了克
2、隆研究。在克隆出ejLFY片段的基础上，利用RT-PCR方法克隆出了ejLFY的cDNA全长，并利用特异PCR的方法克隆出了DNA全长。ejLFY片段登录号为AY5511831，DNA全长登录号为AY5511832。该基因的DNA全长是枇杷上克隆的第一个DNA全长序列。利用分子生物学软件和在线分析软件对克隆出的ejLFY全长基因序列特征进行了分析：ejLFYcDNA全长1227bp，编码408个氨基酸；ejLFYDNA全长2602bp，含2个长度分别为464bp和911bp的内含子，外显子为3段，长度分别为458bp、404bp、365bp。并对编码的氨基酸高级结构进行了预测。此外，进行了u吖
3、同源基因的Southern杂交的初步探索。3、对枇杷成花相关基因ejael进行了克隆研究。在克隆出ejAPl片段的基础上，利用RACE技术(1次3RACE，2次5RACE)克隆出了ejAel的cDNA全长，并利用特异PCR的方法克隆出了ejAPlDNA全长。ejAPl片段登录号码为AY549306(香钟11号)和AY571786(栎叶)，cDNA全长登录号为AY880261，DNA全长登录号为AY880262。利用分子生物学软件和在线分析软件对克隆出的ejAPl全长基因序列特征进行了分析：ejaelcDNA全长720bp，编码239个氨基酸。其DNA全长共3229bp，有6个内含子，7个外显子
4、，外显子和内含子数目符合MADS盒家族的特征，该基因属MADS基因家族。并对编码的氨基酸高级结构进行了预测。4、利用定量RT-PCR的方法对上述两个枇杷成花相关基因在枇杷成花的几个不61同生理阶段及枇杷不同花器官中的表达进行了分析。研究发现，ejLFY在花芽形成的阶段开始表达，直至枇杷小蕾形成阶段后表达消失。在花朵形成后该基因没有表达。值得注意的是该基因在属于营养生长阶段的组培苗中也有少量表达。ejAel基因在组培苗、叶片、叶芽阶段不表达，形成顶花芽后，ejAel的含量急剧升高，并且一直保持到幼果形成阶段仍有表达，但此时的表达量已经降低。其中顶芽、花芽、花序芽、小蕾、中蕾几个阶段的表达量情况相差不多，都比较高，从大蕾阶段开始，ejAel的表达情况开始有所下降，至幼果形成后，ejAel仅有少量的表达。在花器官结构中，ejLFY在萼片中检测到痕量表达，ejAPl检测到除了在萼片、花瓣中有表达外，在柱头中亦有较强的表达。ejAPl的同源基因拟南芥的APl基因属于成花ABC模式中的A类基因，在萼片和花瓣中表达，显然，ejAPl在花器官中的表达与之不同。本研究结果为以后了解枇杷这一木本果树的成花分子机理奠定了必要的基础。62
