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1、东北林业大学 博士学位论文 水曲柳体细胞胚胎发生及体细胞胚与合子胚的发育 姓名：孔冬梅 申请学位级别：博士 专业：森林培育 指导教师：沈海龙 20040601 捅璺 水曲柳( F r a x i n u sm a n d s h u r i c aR u p r ) 是我国东北地区重要的用材树种和园林绿 化树种。在此之前，有关其胚胎发生发育方面的研究报道几乎为零。本文首次对水曲 柳的体细胞胚胎诱导和合子胚与体细胞胚发育的细胞学过程作了系统研究。 在体细胞胚胎发生中，首先对适合离体培养的外植体进行了大范围的搜索，所试 验到的外植体有顶芽、幼叶、幼嫩的复叶轴、花序轴、子房、胚珠、不同发育阶段的 胚
2、和种子、室内水培休眠枝所得的萌发叶等。为了确定适宜水曲柳体细胞胚胎发生的 综合条件，选用了不同基本培养基种类，不同浓度的激素包括N A A 、2 ，4 一D 、I B A 、B A 、 T D Z ，光照条件，蔗糖，水解酪蛋白浓度，p H 值等不同水平的1 0 个因素，试验并确定 了能够诱导水曲柳体细胞胚胎发生的处理。在此基础上，采用完全随机试验法，着重 考察了培养基、激素组合、蔗糖浓度、外植体来源和发育状况等对体细胞胚胎发生的 影响。 在胚胎发育的细胞学研究中，采用石蜡切片法，结合艾氏苏木精整体染色，在光 学显微镜下，对水曲柳体细胞胚胎发生与合子胚的发生发育过程进行了细胞学方面的 观察，并将
3、两个胚胎发生系统进行了对比研究。 体细胞胚胎发生研究的结果表明：( 1 ) 成熟过程中的合子胚是诱导水曲柳体细 胞胚胎发生的最佳外植体材料；( 2 ) 在所试验到的M S 、M S l 2 ( 将M S 的所有成分均减 半) 、W P M 、D K W 、B I 、S H 等六种基本培养基中，M S l 2 是最适合诱导水曲柳体细胞胚 胎发生的基本培养基；( 3 ) 水曲柳的体细胞胚胎发生以直接发生为主，体细胞胚主 要来自于从合子胚分离的完整子叶：( 4 ) 培养基中的激素组合对水曲柳的体细胞胚 胎发生有显著影响，诱导直接体细胞胚发生较好的激素组合有N A Al m g L - ；- I B
4、a2 ，5 ， 1 0 m g L + B A1 0 m g L + T D Z0 0 5 m g L 和N A b , l m g L + I B A1 0 m g L + B A0 ，2 m g L + T D Z0 0 5 m g L ：( 5 ) 合子胚分离的下胚轴具有最强的愈伤组织诱导潜力，少数愈伤 组织可以分化出体细胞胚：( 6 ) 愈伤组织的诱导也受培养基和激素配比的显著影响， 最适宜诱导的培养条件为M S l 2 + N A Al m g L + I B Al O m g L + B A2 ，5 m g L + T D Z 0 0 5 m g L ：( 7 ) 采种时间对体细胞
5、胚胎发生有显著影响。7 月末到8 月中旬的合子胚 具有较强的体细胞胚发生潜力，此时种子尚未成熟，胚乳已呈固态，种胚的各个部分 己分化完全，种胚体积占胚腔的大约2 3 ：( 8 ) 在各自综合的最适条件下，完整予叶 的体细胞胚诱导率可达3 3 6 8 ，下胚轴的愈伤组织诱导率可达9 0 7 a 合子胚细胞学研究表明，水曲柳雌蕊二心皮二室，每室二胚珠，胚珠倒生，薄珠 心，蓼型胚囊。单孢原，大孢子四分体线形排列，通常合点端大孢子为功能大孢子。 核型胚乳，胚乳发育先于胚的发育，胚胎发育为紫菀型。观察中发现了一些异常现象， 表现为四个大孢子中台点端第二个大孢子为功能大孢子，或珠孔端与合点端两个为功 能大
6、孢子。 体细胞胚胎发生的细胞学研究表明，水曲柳合子胚子叶形成的体细胞胚直接发生 于子叶的表皮细胞，为单细胞起源。间接发生的体细胞胚则形成于愈伤组织的表面或 内部。胚性愈伤组织细胞较小，接近圆形，排列紧密，胞质浓厚，核大，核仁明显。 非胚性细胞相对较大，形状不规则，排列疏松或紧密，胞质稀薄，大液泡，核小，偏 向细胞一侧。体细胞胚从心形胚阶段开始出现维管束分化。鱼雷期以后维管柬呈明显 “丫”字形，与母体组织无联系。体细胞胚具明显的极性。 体细胞胚与合予胚的发生程序基本相同，都经历了原胚、心形胚、鱼雷形胚和于 叶胚这几个典型发育时期。其形态发生过程的主要区别在于：( 1 ) 体细胞胚体积通常 小于相
7、同发育阶段的合于胚；( 2 ) 体细胞胚一般没有明显胚柄；( 3 ) 子叶期以后的体 细胞胚在形态上有较多变异。 本研究首次诱譬了水曲柳的体细胞胚胎发生，并筛选了适合水曲柳体细胞胚胎发 生的外植体及培养条件，这是水曲柳离体培养研究上的重大突破，使运用现代生物技 术进行水曲柳的离体快繁和遗传工程成为可能；系统的胚胎发育的细胞学研究，在水 曲柳的胚胎发育生物学研究领域也是首次，对水曲柳育种工作及其它树种相关方面的 研究具有重要的参考价值。 关键词：水曲柳( F r a x i n u s m a n d s h u r i c a R u p r ) ；合子胚；体细胞胚；愈伤组织 A b s t
8、r a c t M a n c h r i a na s h ( F r a x i n u sm a n d s h u r i c a R u p r ) i so n e o ft h ei m p o r t a n tt r e es p e c i e si n N o r t h e a s tC h i n af o rt i m b e rp r o d u c t i o na n d l a n d s c a p ee s t a b l i s h m e n t T h e r ew a s l i t t l er e p o r t o ne m b r y o
9、d e v e l o p m e n to ft h es p e c i e s W es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e ds o m a t i ca n dz y g o t i c e m b r y o g e n e s i s a n di t sc y t o l o g i c a lp r o c e s s T h i si st h ef i r s tr e p o r to nt h e s e s u b j e c t st i l ln o w I nt h es t u d yo fs o m a t i ce
10、m b r y o g e n e s i s ，w es e a r c h e df o rt h ep r o p e re x p l a n t si nl a r g e s c a l e T h e e x p l a n t s t e s t e dw e r e a p i c a lb u d s ，y o u n gl e a v e s ，c o m p o u n d l e a f a x e s ， i n f l o r e s c e n c ea x e s ，o v a r i e s ，o v u l e s ，z y g o t i ce m b
11、r y o sa n ds e e d sa td i f f e r e n td e v e l o p m e n t s t a g e s ，e x p a n d i n gl e a v e sf r o mw a t e r - c u l t u r e db r a n c h e s T e nf a c t o r sc o n t a i n i n gd i f f e r e n t b a s i cm e d i a ，N A A ，I B A ，2 , 4 一D ，B A ，T D z s u c r o s e ，C H ( c a s e i n h y
12、 d r o l y s a t e ) ，l i g h t c o n d i t i o na n dp Hv a l u ea td i f f e r e n tl e v e l sw e r et e s t e di nt h ee x p e r i m e n t T h et r e a t m e n t w h i c hp r o d u c e ds o m a t i ce m b r y o sw a ss e l e c t e d T h e n ，b yu s i n gc o m p l e t e l yr a n d o m i z e d d e
13、 s i g na n ds t a t i s t i c a la n a l y s i s ，e f f e c to fm e d i a ，P G R s ( p l a n tg o w t hr e g u l a t o r s ) ，s u c r o s e c o n c e n t r a t i o n ，e x p l a n t s o u r c e sa n dt h e i rd e v e l o p m e n t s t a g eo n s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sw e r e e s p e c
14、i a l l yi n v e s t i g a t e d I nc y t o l o g i c a ls t u d yo fe m b r y od e v e l o p m e n t ，b yt h ew a yo fp a r a f f i n ，o b s e r v a t i o na n d c o m p a r i s o n i n z y g o t i c a n ds o m a t i c e m b r y o g e n e s i s a n d e m b r y od e v e l o p m e n t w a s p e r f o
15、 r m e d u n d e r l i g h tm i c r o s c o p e T h er e s u l to fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i ss h o w e dt h a t ：( a ) M a t u r i n gz y g o t i ce m b r y ow a s t h eo p t i m a le x p l a n tf o rs o m a t i ce m b r y o g e n e s i so fM a n c h u r i a na s h ( b ) O ft h es i xb a
16、 ! s i c m e d i aM S ，M S l 2 ( h a l f - s t r e n g t ho fM Ss a l t sa n dv i t a m i n s ) ，W P M ，D K W ，B 5a n dS H ， M S l 2w a st h em o s t p r o p e r o n et oi n d u c es o m a t i ce m b r y o s ( c ) S o m a t i c e m b r y o sg e n e r a l l y r e g e n e r a t e dd i r e c t l yf r o me x c i s e dz y g o t i cc o t y l e d o n s ( d ) P G R s ( P l a n tg r o w t hr e g u l a t o r s ) c o m b i n a t i o na f f e c t e ds o m a t
