血红蛋白的提取与分离讲义

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1、 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质 的何种作用，作用结果是什么被破坏？ 变性、变性、空间结构 思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 便于进行DNA的提取，人的红细胞无 细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰 富便于提取血红蛋

2、白。 一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的 通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖 ，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对 分子质量的大小，利用具有网状结构的凝 胶的分子筛作用，来进行分离。 3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（ ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ ），移动速 度（ ），而（ ） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 在（ ）移动，路程（ ）， 移动速度（ ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 大分子通过多孔凝

3、胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 1、概念：在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液： 2、作用： 能够抵制（ ）的对溶液 的（ ）的影响，维持PH基本不变 。 外界的酸或碱 PH值 3、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（ ）使用的 缓冲液。 12

4、使用比例 在不同PH范围内 思考：说出人体血液中缓冲对。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性） 1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。 2）影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 思考：蛋白质为什么带有电

5、荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 电泳： 影响蛋白质分子运动速度的因素 决定 运动方向 电场 作用力 形成 阻力 决定 运动速率 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的 差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分 子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分 子的分离子的分离 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动所带电荷相反的电极移动 许多重要的生物大分

6、子，如多肽、核酸等都许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都 具有可解离的基团，在一定的具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基 团会带上正电或负电团会带上正电或负电 1、原理： 聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交 联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫 酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下 聚合交联成三维网状结构的凝胶 测定（ ）通 常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀 酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量 2 2、常见方法、常见方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

7、它 所带所带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素等因素 原理原理 SDSSDS作用作用 为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响净电荷对迁移率的影响可以在凝胶可以在凝胶 中加入中加入SDS ,SDS ,SDSSDS所带负电荷的量大大超过了所带负电荷的量大大超过了 蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种 电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决 于分子的大小于分子的大小 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝 胶电泳测定蛋白质分子量胶电泳测定蛋白质分子量 应用应用 为了消除

8、静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性 。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作 用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只 是( )。SDS能与各种蛋白 质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷 的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因 而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电 泳迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS 单条肽链的分子量 分子的大小 电泳检测PCR结果 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 1.样品处理 血 液 血浆 水分 固体物

9、质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红 蛋白 （ ） 两个a肽链 两个一肽链 样品处理粗分离纯化纯度鉴定 共四条肽链 90 目的：去除（ ） 方法：（ ）离心（速度越 高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头 吸管吸出上层透明的（ ），将下 层（ ）的红细胞液体倒入（ ） 每个肽链环绕（ ），此基 团可携带（ ）。血 红蛋白因含有（ ）而呈红色。本课题 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分 离血红蛋白。 一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子二氧化碳 血红素 (1)红细胞的洗涤 杂质蛋白 低速短时间 黄色血浆 暗

10、红色烧杯 再加入用（ ）的（ ） 质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤 低速离心（低速短时间） 重复4、5步骤（ ）次，直至上清 液中已没有（ ），表明洗涤干净。 利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗 涤次数过少。 五倍体积生理盐水 三 黄色 (2)血红蛋白的释放 加（ ）到（ ）体积， 再加40体积的（ ）（ 溶解细胞膜） ，置于（ ）上充分搅拌10分钟 （加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋 白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转 移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 原血液 甲苯 磁力搅拌器 蒸馏水 第1层（最上层）： （ ）甲苯层 第2

11、层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体 第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体 第4层（最下层）： 其它杂质（ ）的沉淀层 无色透明 脂溶性物质 白 血红蛋白 红色透明 暗红色 用滤纸过滤， 除去脂溶性沉 淀层，于分液 漏斗中静置片 刻后，分出下 层的红色透明 液体。 取( )ml的血红蛋白溶液装入（ ） 中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量 浓度为20mmol/L的（ ）中， pH为（ ），透析12小时，目的是（ ）或用于更换样品中的（ ）。透 析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸 。 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7.0 缓冲液 (4)透析 1

12、 2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃 管，两端需用砂纸磨平。 底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100 目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞， 中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 （ ），在0.5ml的（ ）头部切 下（ ）长的一段，插入橡皮塞孔内， 上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。 凹穴 移液管 5cm 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮 塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还 会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在（ ）上，用（ ）的尼龙纱将橡皮塞 （ ）包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头

13、部做（ ） ，连接一细的（ ），并用螺旋 夹控制尼龙管的（ ），另一端 放入收集（ ）的收集器内 橡皮塞的凹面 100目 上部 出口部位 尼龙管 打开与关闭 色谱流出液 安装其他附属结构。 顶塞的制作： 插入安装了玻璃管的橡皮塞 组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： （ ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量 的凝胶浸泡于（ ）中充分溶胀后 ，配成（ ）。 蒸馏水 凝胶悬浮液 交联葡聚糖凝胶 固定：将色谱柱处置固定

14、在支架上 装填： 将（ ）一次性的缓慢 倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色 谱柱，使凝胶填装均匀。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶 颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气 泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。 洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( ) 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液（pH为7.0）充分（ ）12小时。 洗涤平衡 注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。 50cm 3）样品加入与洗脱 加样前 打开下端出口，使柱内凝 胶面上的（ ）缓 慢下降到与（ ） 平齐，关闭出口 缓冲液 凝胶面 加透析样品 调整缓冲液面：与凝胶面平齐 滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ） 的样品加到色谱柱的（ ） 样品渗入凝胶床：（ ） 洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 收集：待（ ）接近色谱柱底端 时，用试管收集流出液，每（ ）收 集一试管连续收集 注意正确的加样操作： 不要触及破坏凝胶面