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1、廖振砷等植物生物技术在柑橘遗传改良中的应用 3 9 一 植物生物技术在柑橘遗传改良中的应用 廖振坤1张秋明2 ( 1 湖南省农业厅经济作物处长沙4 1 0 0 0 5 2 湖南农业大学园艺园林学院长沙4 1 0 1 2 8 ) 柑橘种类具有复杂的遗传和生殖生理特性。大多数柑橘品种是高度杂合的( S o o 。t 和 C a m e r o n ，1 9 7 5 ) 。许多性状的遗传是由多基因控制的。通过杂交重组基因有计划地获得亲本 品种的基本性状或优良园艺性状的可能性很低。一些重要的基因型的花粉和胚珠完全不育或 部分不育，不能用作杂交组合的亲本。大多数种类具有无融合生殖的特性，容易从珠心细胞直
2、 接发生不定胚，且具多胚，抑制了合子胚的发育。即使获得了杂交后代，实生苗童期长，大多数 种类在热带和亚热带条件下至少需要5 年才能开花。柑橘的这些遗传特点和生理习性严重妨 碍了柑橘通过传统的育种方法进行遗传改良。尽管一些育种计划在1 0 0 年前就已开始实施， 但进展不大，只有少数品种通过杂交方法而获得，大多数品种一直源于实生选种和芽变选种。 近3 0 年来，随着植物生物技术的发展和应用，许多国家借助离体培养、细胞工程和基因工 程在柑橘遗传育种、品种改良方面取得了重大的突破，如通过体细胞杂交和体细胞胚发生培养 获得新的遗传基因型植株。通过胚乳培养已获得三倍体植株，通过花药培育获单倍体植株。 此
3、外，还通过基因的导入获得转基因柑橘。为柑橘品种改良提供了新的资源，开拓了新的途 径。 1 体细胞胚发生和培养 M a s h e s h w a r i 和R a n g a s w a m y 于1 9 5 8 年首次对受精前后发育中的胚珠和不同时期的种子 进行了培养，认为只有受精的胚珠，在培养中才有反应。B u t t o n 和B o m m a n ( 1 9 7 1 ) ，K o c h b a ( 1 9 7 2 ) ，K o e h b a 和S p i e g e l R o y ( 1 9 7 3 ) 等从未受精胚珠的珠心外植体获得了珠心胚。 柑橘珠心细胞具有胚细胞的潜质。通
4、常不需要生长激素类物质就可获得胚愈伤组织。但 橡檬例外。温州蜜柑愈伤组织的诱导需要赤霉素，S t a r r a n t i n o 和R u s s o ( 1 9 8 0 ) 从早熟果实取出 的种子也获得了胚愈伤组织。 K o e h b a 等( 1 9 7 8 ，1 9 8 2 ) 研究了不同的糖对胚发生和发育的影响。半乳糖、乳糖、棉子糖 ( 甘油) 刺激珠心组织胚胎的发生。K u n i t a k e 等( 1 9 9 1 ) 研究对温州蜜柑只有乳糖有效。 K o c h b a 等( 1 9 8 2 ) X j 沙漠蒂甜橙耐盐株系进行选择。S p i e g e l R o y
5、和B e n H a y y i n ( 1 9 8 5 ) 获得了耐盐植株。D e n g ( 1 9 9 0 ) 等在用7 射线对愈伤组织处理后产生了耐盐的甜橙系。S p i e g e l R o y 等( 1 9 8 3 ) 选择耐2 4 一D 株系，2 4 一D 削弱胚的生存力。T u s a 为了产生抗P h o m a t r a ， c h e i p h i l a 的基因，开展了F e m m i n e U o 柠檬和伏灵夏橙原生质体融合的研究。 H i d a k a 等( 1 9 7 9 ) 首次报道采用枳的花粉培养在试管内分化单倍体植株。1 9 8 2 年和1 9
6、8 4 年又报道分别采用宽皮柑橘和甜橙花粉培养形成了小植株。但对柑橘单倍体植株单倍体特性 尚不清楚。 从胚乳源的愈伤组织诱导体细胞胚，经培养可获得三倍体植株。G m i t t e r 等( 1 9 9 0 ) 从甜 园艺学文集 橙、柚、C m n z ! ”m 的胚乳( 开花后1 2 - 1 4 周切取) 诱导形成了愈伤组织。只有甜橙发育了胚 并再生植株。W a n g 和C h a n g ( 1 9 7 8 ) 曾报道从C 1 7 l o ，T i l ) l a 和甜橙的胚乳培养获得了三倍体小 植株。 C r i n b l a t ( 1 9 7 2 ) ，C h a t u r v
7、 e d i 和M i t r a c ( 1 9 7 4 ) 从茎和叶的外植体也产生了胚性愈伤组织， N i t o 和| w a r n a s a ( 1 9 9 0 ) 还从温州蜜柑的汁囊产生了胚性愈伤组织。 2 原生质体培养 K o c h b a 等( 1 9 7 2 ) 取用沙漠蒂橙胚珠外植体的胚性愈伤组织，V a r d i 等( 1 9 7 5 ) 首次进行了 原生质体的成功培养。V a r d i 等( 1 9 8 2 ) ，K o b a y a s h i 等( 】9 8 3 ) ，G r o s s e r 等( 1 9 9 0 ) 证明柑橘胚珠 源的珠心愈伤组织通常
8、是原生质体再生胚和植株最合适的源。 V a r d i 等( 1 9 8 2 ) 从沙漠蒂橙、丹西橘、V i l l a r r a n c a 柠檬，K o b a y a s h i ( 1 9 8 7 ) 从T r o v i t a 橙等品 种原生质体培育获得的柑橘树已经结果。与原生质体来源的品种果实极为相似。 将源于珠心组织悬浮培养的甜橙原生质体与柚叶肉原生质体融合，获得了与葡萄柚相似 的植株。同样，O h g a w a r a 等( 1 9 9 1 ) 从甜橙叶肉原生质体与珠心细胞悬浮的原生质体融合获得 了与T m y e r 枳橙完全相同的小植物。L i n g 等( 1 9
9、8 9 ) 从C a l a m o n d i n 柑橘成熟果实尚未发育的 胚珠原生质体培养再生了植株。 3 体细胞杂交 从原生质体成功获得植物为体细胞杂交奠定了基础。首例成功的柑橘体细胞杂交是一个 异源四倍体属间杂种，是O h g a w a r a 等( 1 9 8 5 ) 通过T r o v i t a 橙珠心愈伤组织原生质体与枳叶原 生质体融合而获得的。G r o s e r 等( 1 9 8 9 ) 从K e y 柠檬( C i t r u sa u r a n t i f o l i a ) 和伏灵夏橙原生质 体融合获得了种间体细胞杂种植株。之后体细胞柑橘杂种不断增加( K o
10、b a y a s h i 和O h g a w a r a ， 1 9 8 8 ：O h g a w a r a 和K 。b a y a s h i ，1 9 9 1 ；G m i t t e r 等，1 9 9 2 ；F o 等，1 9 9 4 ) 。对四倍体融合植株形态 学、细胞学、同功酶和D N A 限制模型进行了鉴定。 原生质体融合可能证明是跨越有性杂交障碍一个重要的途径。这由哈姆林甜橙原生质体 ( 源予胚悬浮培养) ，与S e v e r i n i ad i s t i c h a 上胚轴源愈伤组织原生质体融合得到了证实( G m s s e r 等，1 9 8 8 ) 。电有部
11、分获得的属间杂种从试管移出后不能继续生长发育，无法存活。表明体细 胞杂交也存在遗传和生理上不亲和的限制，柑橘体细胞杂交步骤以脐橙和默科特橘杂交为例。 通过配子体细胞原生质体融合可获得三倍体，P i r r i e 和P o w e r ( 1 9 8 6 ) ，L e e 和P o w e r ( 1 9 8 8 ) 分别从N i t i a n a 和P e t u n i a 花芽成功分离单倍体配子原生质体，而获得三倍体。 K o b a y a s h i 等( 1 9 8 8 ) 通过体细胞杂交产生的四倍体杂种其性状与母本相比，有所放大。 体细胞杂交为新的重组基因型柑橘接穗和砧木品种育
12、种创造了条件。下表列举了从有性 亲和、不亲和亲本获得的属间体细胞杂种。 廖振坤等植物生物技术在柑橘遗传改良中的应用 从花中切取月E 珠 进行培养 从胚珠诱导的殊心愈伤组织 胤鑫一撬I 一。跨鬟： E 三三虱 脐橙 叵三三j l 无组? q i 刚包群 l 杂核体 叵蚤三j l 胚状体 t 体细包杂种植株 默刚 叵j 没仃分裂 脐橙和科默特体细胞杂交模式 K o b a y a s h i 等1 9 9 8 4 2园艺学文集 表1从有性亲和的亲本通过原生质体融合获得的柑橘属间体细胞杂种 特洛维他甜橙( E s ) + 枳 C s i n e n s l sT r o v i t a ( E S
13、) + O h g a w a r a 等( 1 9 8 5 ) P o n c i u r st r i “i a t a 特洛维他甜橙( E S ) + 特洛亚枳橙( L ) m 幽和O h g a v c a r a ( 1 9 8 8 ) Cs l n e n s i sT r ( w i t ao r a n g e ( E S ) + T r o v e rc i t r a n g e ( L ) ( C s i n e n s l sPt r l f a l i a t a 脐橙+ 特洛亚枳橙 O h g e w a r a 等( 1 9 9 1 ) C S i n e n s
14、 i s N a v e l o r a n g e 十T r o y e rc i t r a n g e 哈姆林甜橙( E s ) + 飞龙枳( 1 ，) C s i n e n s i s H a m l i n o r a n g e ( E S ) + G r o e r 等( 1 9 8 8 ) P t r i k f l i a t aF l y i n gd r a g o n ( L ) 克里帕特橘( E C ) + 飞龙枳( L ) Cr e t i c u l a t ac l e o p a t r am a n d a r i n ( E C ) G r o s s
15、e r 等( 1 9 9 2 ) + P t r i f o l i a t aF I y i n gD r a g o n ( I 。) 克里帕特橘( E c ) + 斯文格枳柚 C r e t i c u l a t aC l e o p a t r o a rn m n d a r i n ( E C ) G t o s s e r + s w i n z l ec i t r a m e l o 伏灵夏橙( E C ) + 梅瓦金柑 C s i n e n s i s v a l e n c i a o r a n g e ( E C ) + D e n g 等( 1 9 9 2 )
16、M e i w a k u n q u a t ( L ) 伏灵夏橙( F c ) 卡里佐枳橙( I ，) C s i n e n s i sv a l e n i ao m n g e ( E C ) + L o u a d a 等( t 9 9 2 ) C a r r i z oc i t r a n g e ( L ) E C = 胚性愈伤组织；E c = 胚悬浮；L = 叶。 亲本和原生质体源 研究人员及时间 哈姆林甜橙( E S ) C s i n e n s i sH a m l i no r a n g e ( E S ) G r o x s e r 等( 1 9 8 8 ) S e v e r i n i ad i 蚶i c b a ( s ( 1 c ) C s i n e n s i sH a m l i n o r a n g e ( E S ) G r o s s e r 等( 1 9 9 2 )
