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1、学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：常瘟 签字日期：年月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直星太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南昌太堂可以
2、将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中 国科学技术信息研究所和中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社将本学位论文收录 到中国学位论文全文数据库和中国优秀博硕士学位论文全文数据库中全 文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ： 签字日期：如年易月 常痛 J 一 7 日 一瓢嘲也 签字日期：砂年6 月7 日 摘要 棉籽蛋白是一种重要的植物蛋白质资源，其氨基酸种类齐全，比例适当， 价格低廉，是一种高质量的食物和饲料用蛋白。棉籽榨油得到的棉籽粕含有 丰
3、富的棉籽蛋白，但由于棉酚的存在，严重影响了棉籽蛋白的开发利用，仅 有少量棉籽蛋自用于饲料添加。随着脱毒技术的发展和无毒棉的培育成功， 给棉籽蛋白的应用开发提供了很好的发展前景。利用脱毒的棉籽蛋白制备有 生理功能的活性多肽，用于保健食品和药品，不但对增进人类健康有着重要 作用，也对延长棉花加工的产业链有着重要的意义。目前使用微生物发酵法 制备棉籽蛋白A C E 抑制肽的深入研究尚未见到详细报道。本论文以脱酚棉 籽蛋白为原料，分离筛选高效安全的生产菌株，发酵制备A C E 抑制肽，通 过对发酵条件的优化，提高棉籽发酵液中A C E 抑制肽的含量，最后使用超 滤、凝胶层析和反相高效液相色谱对发酵液中
4、的A C E 抑制肽进行分离纯化， 并鉴定A C E 抑制肽的氨基酸序列，为棉籽蛋白的开发提供理论依据和技术 支持。主要结果如下： 1 从分离到的乳酸菌和芽孢杆菌中筛选出产蛋白酶的菌株，根据菌株 对棉籽蛋白的水解能力以及发酵液的A C E 抑制率，选择最适的发酵菌株。 结果表明，从选用的泡菜汁中获得了4 株乳酸茵，分别标记为L l L 4 。通过 观察这4 株乳酸菌和枯草芽孢杆菌N C T 3 1 4 酪蛋白水解圈的有无可以发现， 除了乳酸菌L 3 之外，其余4 株菌都可以产生蛋白酶。将产蛋白酶的菌株接 种到棉籽蛋白发酵培养基中进行发酵，检测结果表明，枯草芽孢杆菌N C T 3 1 4 发酵棉
5、籽蛋白发酵液的水解度和A C E 抑制率为最高，分别为1 8 3 6 和6 4 8 6 。因此选择枯草芽孢杆菌N C T 31 4 作为棉籽蛋白A C E 抑制肽的发酵菌株。 2 以脱酚棉籽蛋白为原料，以枯草芽孢杆菌N C T 3 1 4 为发酵菌，对其 发酵条件进行了优化。首先以水解度和A C E 抑制率为指标，进行了不同发 酵时间( O 、6 、1 2 、2 0 、2 2 、2 4 、2 6 、3 0 、3 6 、4 8 、6 0h ) 、不同发酵温度( 2 7 、 3 0 、3 2 、3 5 、3 7 、4 0 、4 2 、4 7 ) 、不同p H ( 6 O 、6 5 、7 O 、7
6、5 、8 O ) 和 不同接种量( 1 、3 、5 、7 、9 ) 的单因素试验，结果表明，当发 酵时间为2 4h ，发酵温度为3 2 ，p H 为7 0 ，接种量为5 时，棉籽蛋白 发酵液A C E 抑制肽的产量可达到最好。在单因素试验结果的基础上，以发 酵液A C E 抑制率为响应值，选取发酵温度、发酵时间和p H 这三个影响显著 的因素，设计响应面试验。通过响应面试验对以上发酵条件的优化，得到最 佳发酵条件为：温度3 2 0 8 、时间2 2 6h 、p H 为7 2 ，若在此发酵条件下， 摘要 发酵液的A C E 抑制率最高可达7 8 0 6 。 3 对发酵液中的A C E 抑制肽进行
7、了分离纯化。将棉籽蛋白发酵液中的 A C E 抑制肽经超滤、凝胶层析( S e p h a d e xG 2 5 ) 和反相高效液相色谱 ( I 冲m ，L C ) 分离纯化。结果表明，棉籽蛋白发酵液经超滤分离后可分为4 个组分，分别是U l ( 3 0k D a ) 、U 2 ( 3 0 1 0k D a ) 、U 3 ( 1 肛5l ( D a ) 和U 4 ( F 总模型 1 5 1 3 4 5 91 6 8 1 68 0 8 l F 总模型 7 2 1 6 8 0 8 l 0 0 0 0 l X l 5 2 l1 0 4 3 6 o 0 0 0 l X 2 1 0 44 1 9O 0
8、7 9 9 x 3 8 6 6 2 8 8 2 4 0 o o O l X 1 2 9 9 72 0 1 2 8 3 0k D a ) 、U 2 ( 3 0 1 0k D a ) 、U 3 ( 1 5k D a ) 和U 4 ( 5k D a ) ，各组分具 有不同的A C E 抑制活性( 见表4 2 ) ，其中U 4 ( 3 0 k D a ) 。试验结果与J u n g 的研究结果相符，即经过低分子量( 5k D a ) 超滤膜截 留的组分具有较好的A C E 抑制活性【1 0 9 】。超滤后组分A C E 抑制活性提高的原因 可能是超滤去除了发酵液中原有的大分子物质，对A C E 抑制肽
9、起到了富集作用， 提高了发酵液的A C E 抑制活性。因此，选择U 4 ( 3 0 k D a ) U 2 ( 3 0 1 0k D a ) U 3 ( 1 0 5k D a ) U 4 ( 5 k D a ) 4 4 2 经S e p h a d e xG - 2 5 凝胶层析分离后各组分的A C E 抑制力 1 6 7 9 6 2 3 3 2 8 l L O O 0 如 铀 如 如 如 7 8 2 6 4 6 L l 7 9 6 1 4 2 0 第4 章棉籽蛋白A C E 抑制肽的分离纯化 图4 1 经S e p h a d e xG 2 5 分离后各组分的图谱 F i g 4 11 k
10、丘徼t i o r I ss e p a m t e db yS e p h a d e xG 一2 5 由图4 1 可知，超滤组分U 4 ( 3 0k D a ) 、U 2 ( 3 肚1 0 k D a ) 、U 3 ( 1 k D a ) 和U 4 ( 5k D a ) 。经检测，U 4 ( 5k D a ) 具有较强的 A C E 抑制能力，I C 5 0 为O 9 4m g r n L 。 4 5 2 使用S 印h a d e XG - 2 5 凝胶色谱对U 4 ( 3 0k D a ) 、U 2 ( 3 啦! Ok D a ) 、U 3 ( 1 肛5k D a ) 和 U 4 ( 5
11、k D a ) 。其中，U 4 组分具有较强的A C E 抑制能力，其I C 5 0 为O 9 4m 幽n L 。 U 4 组分经S 印h a d e XG 一2 5 分离后可得到3 个洗脱峰，分别标记为S l 、S 2 和S 3 。 第5 章结论与展望 通过测定各洗脱峰的A C E 抑制活性可知，组分S 2 的A C E 抑制能力最强，I C 5 0 可达O 1 9m m L 。使用制备型R P H P L C 可进一步将S 2 分成5 个峰组分，分别 编号为1 5 号，收集各峰组分，经测定，4 号峰组分具有较强的A C E 抑制能力， 其A C E 抑制率可达8 3 7 7 。分析型I 冲
12、H P L C 纯度鉴定组分为由一个肽段组成 的组分。经测定，4 号峰是一个由五个氨基酸连接成的肽段，其氨基酸序列为 L P G V Y ( L e u - P r o G l y V 矾一1 W ) 。 5 2 研究的创新点 5 2 1 筛选到一株能水解棉籽蛋白产生A C E 抑制肽的菌株枯草芽孢杆 菌N C T 3 1 4 。 5 2 2 从棉籽蛋白发酵液中分离获得具有A C E 抑制活性的多肽，其氨基酸序 列为L P ( Y ( L e u - P r 0 - G l y - V m 一1 如) 。 5 3 建议 5 3 1 所得到的A C E 抑制肽在动物体内的活性及其活性大小，需要进
13、一步的 实验证实。 5 3 2 根据得到的A C E 抑制肽的氨基酸序列，合成该抑制肽并研究其活性和 构效关系。 4 l 致谢 致谢 本论文是在我的导师曹郁生教授的悉心指导下完成的。从论文的选题到研究 思路及研究方法，都得到了曹老师的精心指导，使我获益非浅。在这三年里，曹 老师严谨治学的态度、渊博的知识、诲人不倦的精神和博大宽广的胸怀给我留下 了深刻的印象，使我受益终生。借此机会，谨向恩师致以衷心的感谢和真挚的祝 福! 在这里，非常感谢许杨教授、谢明勇教授、邓泽元教授、魏华教授、陈红兵 教授、熊勇华教授，熊华教授实验室为我提供的便利条件，确保课题按时完成。 同时，感谢刘晓华老师、李海星师兄、黄
14、桂东师姐、陈燕、仇婷、杨小龙、 李超波、朱义松、李文明、杨文华等各位实验室成员为本课题的顺利结题提供的 帮助。 感谢生命科学与食品工程学院和中德联合研究院的各位领导和各位老师；感 谢我的家人和朋友，是他们给我不断前进的动力。 最后，再一次对帮助过我的老师，同学和朋友表示感谢1 4 2 常通 2 0 1 0 5 1 1 参考文献 参考文献 【1 】马丽娜鸡胚多肽的提取及初步分离纯化研究【D 】山东：山东农业大学，2 0 0 7 ：5 【2 】阚建全食品化学嗍北京：中国农业大学出版社，2 0 0 4 ：1 5 3 一1 5 4 【3 】M a r kDL ，G o r e sGJ ，L a r u
15、 S s oNF H e p a t i cp r o c e s s i n go fp e p t i d e si n ：p e p t i d e _ b 弱e dd r u g d e s i 班【M 】A C SP r o f e s s i o m lR e f e r e n c eB 0 0 k W 础i 呼叽D C ，1 9 9 5 ，2 2 l 2 3 9 【4 】D a V i dTT ，D a V i dJKA 瓶e t r i o e ta 1 S i n 姐o I l sH + 忸i p e p t i d ea b s o 印t i o na c r o s s
16、t h eh 啪锄 硫e s t i n a l e p i t h e l i u m i sc o n 廿o l l e d i n d i r e c t l y v i aa 缸l c t i o I l a lN a + ，H + e x c h a l l g e r阴 G 豁咖e n t e r o l o g y 2 0 0 2 ，1 2 2 ( 5 ) ：1 3 2 2 1 3 8 9 【5 】E h u dZ ，M o i s eB I n t e s t i 眦la b s o 州o no fp 印t i d e st 量l r o u 曲m ee 眦眦妒s 卧M i c 啪S cR e s T e c l l n i q 2 0 0 0 ，4 9 ：3 4 6 4 l9 【6 】S c t
