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1、广西大学 硕士学位论文 植物乳杆菌A6（lactobacillus plantarum A6）生物学特性及 在发酵饲料中应用的研究 姓名：刘金萍 申请学位级别：硕士 专业：动物营养与饲料科学 指导教师：王士长 20040501 植物乳丰T 茁A 6 ( L a c t o b o c i l l u s p l a n t a r u m 月印生物学犍壁墨童垄酵迥料中壁里堕塑窭 植物乳杆菌A 6 ( 口c 幻6 a c f 甜sp 肠门彻，“mA 6 ) 生物学特眭 及在发酵饲料中应用的研究 摘要 本研究主要对植物乳杆菌A 6 生物学特性、植物乳杆菌A 6 发酵饲 料最佳发酵条件的筛选以及发酵
2、饲料在断奶仔猪中的应用方面进行研 究。主要研究结果如下： 试验一：通过对植物乳杆菌A 6 高温高压耐受| 生、直接将淀粉分解 成乳酸能力等方面的研究，结果表明植物乳杆菌A 6 具备耐受8 0 、 0 2 0 K g c m 2 蒸汽压力的能力、直接将淀粉分解成乳酸的能力等特性。 试验二、选用正交表L 、。( 4 5 ) 来安排正交试验，筛选出植物乳杆 菌A 6 发酵断奶仔猪料的最佳发酵时间、接种量、发酵温度、p H 值和湿 度。五因素对乳酸产率的影响次序依次为：接种量 温度 湿度 时间 p H ；最佳发酵条件为：接种量1 0 ，温度3 7 ，湿度6 5 ，时间4 8 h ， p H 值6 5
3、。 试验三：通过断奶仔猪的饲养试验和消化试验来评定植物乳杆菌 A 6 发酵断奶仔猪料对断奶仔猪的营养价值。试验结果表明植物乳杆菌 A 6 发酵断奶仔猪料能显著提高断奶仔猪的试验末重( P l S m m ： 2 0 植物乳杆菌 “L a c t o b a c i l l u J p l a n t a r u m 印生物学特性盈在发酵饲料中应用的研究 中敏：抑菌圈直径l 卜1 5 r a m ； 低敏：抑菌圈直径5 一l O m m ； 不敏或无效：无抑菌圈。 12 9 植物乳杆菌A 6 与微量元素之间的关系 5 L 6 8 ： 采用滤纸片扩散法。自配铜：2 5 0 p p m 、锌：3 0
4、 0 0 p p m 、铜+ 锌：2 5 0 + 3 0 0 0 p p m ； 市购4 猪用预混料4 3 1 2 ( 小猪料) 、4 3 1 3 ( 中猪料) 、4 3 1 4 ( 大猪料) 、4 3 2 5 ( 怀 孕母猪料) 、4 3 2 6 ( 哺乳母猪料) ；按以上浓度溶于无菌水中，采用滤纸片扩散法， 根据纸片直径大小作出敏感性判别( 判断标准与1 27 相同) 。 I2 I O 植物乳酸菌A 6 不同条件下存活率的测定“： 1 2 1 0 1 取l m l 植物乳杆菌A 6 用无菌生理盐水稀释1 0 倍，置于8 0 。C 、0 2 0 K c m 2 蒸汽压力下，处理l O 分钟(
5、 一般颗粒料制粒条件) ，钡0 定此时的活菌数。 1 2 1 0 2 取i m l 植物乳杆菌A 6 ，用麸皮为载体稀释1 0 倍，5 5 。C 下烘干，按l 添 加量在室温下与配合饲料( 乳猪料) 混合均匀，放置2 周、4 周时分别测定一下植 物乳杆菌A 6 活菌数。 2 结果与讨论 2 1 植物乳杆菌A 6 的形态： 在5 号固体培养基上培养，形成直径0 5 m m 一2 m m ，白色：圆形，表面光滑 湿润，边缘整齐、凸起的菌落。革兰氏染色阳性，菌体杆状( 见图l ，1 ) 。 图1 1 植物乳杆菌A 6 的形态特征 F i g 1 _ 1T h em o r p h o l o g y
6、c h a r a c t e ro f L p l a n t a r u mA 6 2 2 植物乳杆菌A 6 的生长曲线： 生长曲线的绘制及O D a 2 。值与p H 值之间的关系( 见图l 一2 、表i 1 ) 2 1 堕查兰堡主堂垡堕兰 堕塑! ! 量苎皇篁! 竺竺! 竺坐塑竺：! 竺! 型圭塑兰壁丝墨垄垄壁塑型生皇里塑竺壅 T 表1 1植物l i L 杆i l lA 6 生长t ( h ) 、O D 4 2 0 值与p H 值之间的关系 爿6 图卜2植物乳杆菌A 6 生长曲线 F i g I 2T h eg r o w t hc u r v eo f L p l a n t a r
7、 u m 4 6 从图1 2 可以看出，植物乳杆菌A 6 从第2 h 开始进入对数生长期，在1 8 h 对 数期结束。在此阶段，植物乳杆菌A 6 生长活跃，大量繁殖，导致介质p H 值降低， 图1 2 中p H 值变化规律与此相符。 2 3 植物乳杆菌A 6 耐高温的测定结果： 表1 - 2温度对生跃的影响 T a b l el 一2 E f f e c t o f t e m p e r a t u r eO i l t h e g r o w t ho f L p t a n t a r u m A 6 温度 3 76 0 6 57 07 58 08 5 9 0 0 D 4 2 0 值0
8、4 1 5 0 3 90 3 8 1 0 3 60 3 4 20 3 10 2 2 100 1 8 图l _ 3 温度对生长的影响 F 嘻I - 3E f f e c t o f t e m p e r a t u r eO i l t h e g r o w t ho f L p l a n t a r u m A 6 从以上图表可以得出，随着温度升高，O D 4 2 0 值降低，但8 0 高温时植物乳杆 菌A 6 还可以较好的生长，说明植物乳杆菌A 6 对高温具有一定的耐过性，普通乳 J 西大学碗：L 学位论文植物乳杆菌a 6 ( L a c l o b a c i l h t s p c
9、 l n l a r u r n A 6 ) 生塑兰壁竺墨垄塞壁塑型! 生里堕旦塞 酸菌一般只能耐受7 0 。C 的温度，而国内现在一般畜禽饲料的制粒温度为7 0 “ C 8 5 ，所以植物乳杆菌A 6 耐高温这一特性决定了其比普通乳酸菌更为广泛的用途。 2 4 植物乳杆菌A 6 将淀粉直接分解成乳酸能力的测定结果： 表1 3 植物乳杆菌A 6 分解淀粉产乳酸能力的测定结果 T a b l e1 3 T h e m e a s u r e m e n tr e s u l t o f t h ea b i l i t yo f L p l a n t a r u m A 6 t od e c
10、o m p o s e s t a r c hi n t oI a t t i ca c i d 注：乳酸产率= 乳酸产量( g 1 0 0 m 1 ) ( 1 0 0 - 湿度) 从上表可以看出，植物乳杆菌能直接将淀粉分解成乳酸，根据一般微生物 的作用模式为6 0 1 ： 芽孢杆菌作用乳酸菌作用 淀粉+单糖乳酸 本次研究证实了植物乳杆菌A 6 的作用模式为： 植物乳杆菌A 6 作用 淀粉卜乳酸 此项研究结果同E R I CG I R A U D 等5 9 1 人的研究相一致，即植物乳杆菌A 6 可以直接将不经任何处理的淀粉分解成乳酸，从上表看出，随着发酵时间延长， 乳酸的产率提高，而玉米乳酸
11、的产率比淀粉高，可能主要因为淀粉溶解于水后， 就出现沉淀，且沉淀物之间黏结性很强，不利于植物乳杆菌A 6 充分同其接触， 不能充分进行发酵产酸，而玉米粉沉淀则较为疏松，较利于产酸。 2 5 植物乳杆菌A 6 耐酸性的测定结果： 表1 - 4 植物乳杆菌A 6 耐酸性的测定结果 T a b l e1 - 4T h em e a s u r e m e n tr e s u l to fa c i dt o l e r a n c eo f L p l a n t a r u m 1 6 从结果中可看出，植物乳杆菌A 6 对酸性有一定的耐过性，在p H 值4 0 时有 l 的耐过性。大多数乳酸菌对
12、酸性都有定的耐过性。 2 6 植物乳杆菌A 6 耐受胆盐、人工胃液能力的测定结果； 2 3 广西大学硕士学位论文 植物乳杆茁A 6 ( L a c t o b a c i l l u s p l a n t a r z t m 一司生物学特性及在发酵饲料中应用的研究 表1 5猪胆盐的耐受性 T a b l e1 - 5T h et o l e r a n c eo fp i gb i l es a l t 表l - 6 人工胃液的耐受性 从以上结果看出，植物乳杆菌A 6 对消化道胆盐没有耐过性，但对消化道胃酸 有一定的耐受性( 为0 7 5 0 ) ，此项研究说明如果将植物乳杆菌A 6 直接饲
13、喂动物 将因为不能耐过消化道的胆盐环境，而取不到理想效果。 2 7 植物乳杆菌A 6 药敏试验测定结果： 表l 一7 植物乳杆菌A 6 药敏试验测定结果 T a b l e1 7 T h er e s u l lo f m e d i c i n es e n s i b i l i t yo f L p l a n t a r u m A 6 药品名称 浓度 抑菌圈直径( r a m ) 敏感性判定 金霉素2 7 1 3 3 丙丽一 土霉素2 7 1 。 3 4 高敏 痢特灵0 6 7 1 7 高敏 黄霉索2 0 o1 4 中敏 氟哌酸 o 0 2 5 o1 8 高敏 喹乙醇0 3 0 1
14、0 中敏 防霉剂 O 1 0 9 低敏 克氧o 1 0 1 2 中敏 脱霉素01 0 7 低敏 杆菌肽锌0 3 0 I O 中敏 从上表可以看出，植物乳杆菌A 6 对大多数药物比较敏感，所以在应用过程中 一定要避免与某些致敏性药物接触，否则，植物乳杆菌A 6 将会失活。 2 8 植物乳杆菌A 6 体外抑菌试验结果： 表1 8 植物乳杆菌A 6 体外抑菌试验结果 T t a b l e1 。8T h er e s u l to fs u p p r e s s i n gt h eg e r mo u t s i d e 病原菌 抑菌圈直径( r a m ) 敏感性判定 沙门氏菌9 低敏 全重鱼
15、塑堕堡堕 ! 堡堡 2 4 堕查兰霎圭兰些笙兰 堕塑塾堑堕! 皇! 竺! ! 丝! ! ! 竺型! ! 竺! ! ! 型生塑兰笪堡墨垄茎翌塑堕塑兰墅! ! ! 里旦 从表1 8 可以看出，植物乳杆菌A 6 对致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌敏感性都较低，而实验室或临床实践研究表明，乳酸菌对肠道细菌如大肠 杆菌、沙门氏菌等引起的肠道感染、腹泻等疾病有保护预防性作用6 2 彤】。乳酸菌 代谢后产物对致病菌的拮抗作用及竞争排斥作用被认为是上述功能的主要因素 1 6 6 1 。如乳酸菌产酸，如乙酸、丙酸、乳酸等酸对有害菌起生长抑制作用【6 7 J ，而乳 酸菌本身对这些有害菌的抑制作用是有限
16、的，所以植物乳杆菌A 6 的体外抑菌试验 出现上述结果。 2 9 植物乳杆菌A 6 与饲料中微量元素之间关系的测定结果： 表I 一9 植物乳杆菌A 6 与饲料中微量元素之间的关系 T a b l e l - 9 T h er e l a t i o nb e t w e e n L p l a n t a r u m A 6a n d t r a c e m i n e r a l s i n f e e d 从E 表看出，饲料中的微量元素高铜、高铜+ 高锌对植物乳杆菌A 6 有一定的 抑制作用。高铜作为一种类抗生素物质在猪的饲料中被广泛使用。高锌也作为防 治仔猪腹泻的理想物质被使用而它们与微生态制剂之间的关系很少被重视。此 项研究，初步探讨了高铜、高锌以及猪用预混料( 不同铜、锌含量) 同植物乳杆 菌A 6 之间的关系，说
