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1、分类号： S432 单位代码： 10335 密 级： 无 学 号： 10616060 博 士 学 位 论 文 中文论文题目：中文论文题目：桑细菌性枯萎病病原学及其致病机理研究桑细菌性枯萎病病原学及其致病机理研究 作者姓名： 王 国 芬 指导教师： 谢关林 教授 合作导师： 刘 波 研究员 专业名称： 植 物 病 理 学 研究方向： 植 物 细 菌 学 所在学院： 农业与生物技术学院 论文提交日期论文提交日期 2009 年年 9 月月 14 日日 桑细菌性枯萎病病原学及其致病机理研究桑细菌性枯萎病病原学及其致病机理研究 论 文 评 阅 人 隐 名 评 阅 隐 名 评 阅 隐 名 评 阅 隐 名
2、评 阅 隐 名 评 阅 答辩委员会主席 陈剑平 研究员 答辩委员会委员 刘 波 研究员 谢关林 教 授 宋凤鸣 教 授 张立钦 教 授 马忠华 教 授 论 文 答 辩 日 期 2009 年 9 月 13 日 Etiology and Pathogenicity Mechanisms of the Mulberry Wilt Disease in China By Wang Guo-Fen A Dissertation Submitted as Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosop
3、hy in Plant Pathology in ZHEJIANG UNIVERSITY Supervisor: Prof. Xie Guan-Lin Hangzhou, 310029 Zhejiang, Peoples Republic of China July, 2009 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学浙江大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的
4、说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江大学浙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权浙江大学浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 致 谢 本研究是在导师谢关林教授和刘波研究员
5、的精心安排和悉心指导下完成的。三年 的博士学习，从论文的选题、试验路线和技术方案的拟订、实施，到论文的撰写和校 对，都凝集着导师的智慧、心血和汗水。两位老师渊博的知识，严谨的治学态度，不 懈的科研追求和一丝不苟的精神是我受益终身的宝贵财富，也是我学习的榜样。至此 论文完成之际，献上我深深的敬意和感谢。 在平时的工作和生活中，我得到了本实验室李斌师兄、楼妙苗、方媛、苏婷、王 芳、邱文和刘君英等师妹们，以及师弟朱勃和余山红的热情帮助。感谢她们在三年的 学习生活中给予我的关心。 浙江大学 985 平台实验室孟春梅、徐幼平和李金辉老师在激光共聚焦拍照和物质 分析试验中使我受益良多，感谢泰国 Khon
6、Kaen 大学访问学者 Praphat Kawicha 老师 在试验中给予的帮助，浙江大学的王芳、李芳同学亦为本试验付出了辛勤的劳动。感 谢浙江省农业厅经济作物局高级农艺师周勤，杭州市植保土肥总站推广研究员徐福 寿，浙江省植物保护检疫局推广研究员王建新在材料准备中给予的方便。 感谢福建省农科院农业微生物资源研究中心全体同事的无私帮助。感谢蓝江林、 刘丹莹、肖荣凤、郑雪芳、陈璐、林营志、刘国红、林抗美、史怀、苏明星、周先治 等同事，在工作和生活中给予我的帮助。感谢车建美博士在试验中给予的全力支持， 厦门大学的张赛群老师、谢忠老师为本实验提供了良好的便利条件。特别感谢美国农 部农业服务部佛罗里达柑
7、桔遗传研究中心（USDA-ARS-USHRL）Duan Y. P 教授和 Benyon L. S 博士在论文发表中给予的细心修改和指导。 在此，我还要感谢海南省中国热带农业科学院环境与植物保护研究所的领导和老 师们，感谢微生物农药资源研究中心黄俊生研究员和课题组所有成员在学习工作中给 予的支持。 最后我要特别感谢一直默默关心我、爱护我的父母和哥哥，姐姐，他们的支持和 鼓励是我努力向前的原动力。感谢我的挚友李剑、郭钦和兀旭辉，是他们的关心陪伴 我度过了这三年的学习和生活。 再次向所有关心和帮助过我的老师、同学、朋友和亲人们献上我最诚挚的谢意! 王国芬 2009 年 7 月 于浙大华家池畔 目 录
8、 致 谢.V 摘 要.V AbstractVII 1 文献综述1 1.1 桑树细菌性病害概况 .1 1.1.1 桑细菌性疫病（Mulberry Bacterial Blight） 1 1.1.2 桑青枯病（Mulberry Bacterial Wilt）. 2 1.1.3 桑枝软腐病（Mulberry Shoot Soft Rot） 3 1.1.4 桑叶日灼病（Mulberry Leaf Scorch） 4 1.1.5 桑细菌性叶斑病（Mulberry Bacterial Leaf Spot）. 4 1.1.6 桑树植原体病害（Mulberry Mycoplasmas Disease） 4 1
9、.2 肠杆菌与植物病害.5 1.2.1 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）概况. 5 1.2.2 肠杆菌属中的植物病原菌 7 1.2.2.1 生癌肠杆菌（E. cancerogenus） 7 1.2.2.2 阴沟肠杆菌（E. cloacae） 8 1.2.2.3 阴沟肠杆菌溶解肠杆菌亚种（E. cloacae subsp. dissolvens） . 9 1.2.2.4 超压肠杆菌（E. nimipressuralis） . 9 1.2.2.5 梨形肠杆菌（E. pyrinus） 9 1.2.3 肠杆菌的分离鉴定 . 9 1.2.3.1 基本分离及鉴定方法. 10 1.2.3.2
10、 致病性测定 .11 1.2.3.3 生理生化鉴定方法 12 1.2.3.4 分子生物学鉴定 12 1.2.4 肠杆菌的其他研究 . 16 1.2.4.1 植物生防菌 . 16 1.2.4.2 植物促生菌 16 1.2.4.3 生物降解菌 17 1.2.4.4 生物产氢菌 . 17 1.2.4.5 在食品生产中的潜在危害. 18 1.3 植物来源肠杆菌的研究热点 .18 1.3.1 肠杆菌作为生防菌和植物促生菌在作物中的定殖机制研究 18 1.3.2 生物标记在肠杆菌与植物互作研究中的作用 19 1.3.3 生物多样性和基因多态性的研究. 20 1.3.4 肠杆菌新植物细菌病害的研究报道 21
11、 1.4 新病害报道的程序与引起植物细菌病害的病原种类21 1.5 本研究的背景及研究内容与目的 .25 1.5.1 研究的背景 . 25 1.5.2 研究的内容与目的 . 26 2 桑树细菌性枯萎病的病原学研究 27 2.1 材料和方法.28 2.1.1 病害调查、病原分离及致病性测定 28 2.1.1.1 田间症状与描述 28 I 2.1.1.2 病害样品的采集及其病原菌的分离纯化和保存. 28 2.1.1.3 病原菌的致病性鉴定. 28 2.1.2 病原菌的形态及基本生理生化特性. 30 2.1.2.1 菌落及菌体形态观察. 30 2.1.2.2 生理生化特性 . 30 2.1.2.3
12、碳源利用（Biolog法）. 30 2.1.3 病原菌抗生素抗性鉴定 31 2.1.3.1 抗生素 . 31 2.1.3.2 不同浓度抗生素溶液制备 31 2.1.3.3 测试菌/培养基混液准备 . 31 2.1.3.4 纸片法对测试菌的抗生素敏感性测定 31 2.1.4 病原全细胞脂肪酸鉴定 . 31 2.1.4.1 试剂、仪器及分析软件. 31 2.1.4.2 脂肪酸的提取过程：. 32 2.1.4.3 脂肪酸的检测 . 32 2.1.5 病原菌 16S rDNA及RNA聚合酶基因（rpoB）的序列测定. 33 2.1.5.1 试剂和仪器 . 33 2.1.5.2 细菌DNA抽提 33 2
13、.1.5.3 PCR扩增 34 2.2 结果与分析.36 2.2.1 桑树细菌性枯萎病病害症状描述 36 2.2.1.1 田间症状描述 36 2.2.1.2 接种症状描述 36 2.2.1.3 番茄组培苗致病性测定. 38 2.2.2 桑树细菌枯萎病病原菌的特征 38 2.2.2.1 形态观察 38 2.2.2.2 生理生化和碳源（Biolog）利用特征. 39 2.2.3 病原菌全细胞脂肪酸鉴定结果 44 2.2.4 病原菌两个基因序列的鉴定 46 2.2.4.1 16S rDNA序列分析 46 2.2.4.2 RNA聚合酶基因（rpoB）的序列鉴定. 47 2.2.5 病原菌抗生素抗性鉴定
14、 50 2.3 讨 论.50 2.3.1 肠杆菌引起的桑树细菌性枯萎病的特点. 51 2.3.2 引起桑“枯萎”病的病原菌肠杆菌的特征 51 2.3.3 桑树“枯萎”病和桑树“青枯”病症状与病原的区别 52 2.3.4 肠杆菌引起植物细菌性病害的特征 54 2.3.5 植物致病肠杆菌的序列分析 55 2.4 本章小结.56 3 利用gfp/lux双标记研究桑细菌性枯萎菌致病机理 .57 3.1. 材料与方法57 3.1.1 强致病菌株的gfp/luxAB双基因标记 57 3.1.1.1 菌株、质粒及培养基 57 3.1.1.2 试剂及仪器 58 3.1.1.3 Enterobacter sp.
15、 R18-2 感受态细胞的制备. 58 3.1.1.4 质粒提取 59 II 3.1.1.4 Enterobacter sp. R18-2 的电击转化. 59 3.1.1.5 阳性转化子的荧光检测 59 3.1.2 GFP标记菌的PCR检测及序列测定 59 3.1.2.1 菌落PCR法对标记菌的GFP基因进行检测. 59 3.1.2.2 标记菌的验证 . 60 3.1.3 标记菌的特性研究 60 3.1.3.1 菌落形态和菌体形态观察 60 3.1.3.2 流式细胞仪检测 . 60 3.1.3.3 GFP标记对菌株生长的影响 60 3.1.3.4 标记菌株R18-gfp-1 中GFP表达稳定性
16、. 61 3.1.3.5 标记菌株R18-gfp-1 的致病性 61 3.1.4 GFP标记菌在感病植株体内的定殖研究. 61 3.1.4.1 原始菌和GFP标记菌在桑树体内的增殖 . 61 3.1.4.2 原始菌和GFP标记菌在番茄组培苗体内的增殖 . 62 3.1.4.3 GFP标记菌在番茄组培苗组织细胞寄生能力的观察 63 3.2 结果分析.63 3.2.1 桑树细菌性枯萎病病原菌的gfp/luxAB基因双标记. 63 3.2.1.1 阳性转化子的荧光检测. 64 3.2.1.2 阳性转化子的gfp-PCR鉴定 65 3.2.1.3 标记菌的 16S rDNA基因部分序列分析 65 3.2.2 GFP标记菌的特性研究. 66 3.2.2.1 菌落形态和菌体形态观察 66 3.2.2.2 GFP标
