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1、扬州大学 硕士学位论文 构建染色体单片段叠代系，精确定位水稻2个重要性状基因 姓名：吴旭江 申请学位级别：硕士 专业：植物生物技术 指导教师：潘学彪 20080601 扬州大学硕士学位论文 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 4 2 _ 一 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。 除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本 文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人 承担。 学位论文作者签名： 蜘 期：砂3 年6 月哆日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学
2、校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大 学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录 到 与受体表型性状熬翁单魄较，霹以把星标牲状Q T 耀定位予 代换片段上；剥雳不同S S S L 之间染色体片段的部分重叠性，可以把数量性状Q T L 定位到更小的区域杰( 重叠区域非重叠区惠) 【4 1 ；纯含S S S L 遗传上的稳定性，使其 可以在不同地点、不同季节、多重复、大群体设置同一
3、实验，有效地消除了环境 误差，使Q T L 定位更精缨更准确。Q T L 的精细定位，为进一步的基因克隆奠定了 基础。 和传统的基因效应分析方法相比，利用S S S L 迸行基因效应分析变得相对简 单。加性和显性效应的计算，只需要魄较S S S L 的缝合体、杂合体及受体三者在 某一数量性状上表型的差异；土位性效应的分析，只要把2 个纯含的S S S L 杂交， 调查其簸 弋群体凌各单株不同标记基匿型阀隧标性状舱表现型的差异。S S S 遗 传上的稳定性，使其可以同时被种植在几个环境中，用子研究特殊Q T L 与环境的 互作效应；还可以把S S S 毛与不同的测验种杂交，用于研究Q T L 与
4、遗传背景的夏 作。 构建多个供体来源、代换片段能相互重叠，且能覆盖整个基因组的S S S L 群 体对水稻Q T 己定位和功能基因组学研究具有十分重要的作用。A i 蠡等【8 】以籼稻品 种“I R 2 4 为轮回亲本，以粳稻品种A S o m i n o r i 为供体亲本，利用R f L P 标记获得了 基本覆盖整个基因组酶导入系( I L ) 约7 0 个。D o i 等阴激非洲栽培稻娃 勘g 拶妇谚至R G e1 0 4 3 8 建供体亲本，获得了9 1 个以粳稻晶种台中6 5 为遗传背景 的染色体代换系( C S L ) 。S o b 糠z 雒等i 1 锷以展颖野生稻毋g 缸跚娌刎穰
5、酗为供体亲 本，栽培稻“台中6 5 ”为受体亲本，建立的导入系群体覆盖了基因组的大部分区域。 K u r a k a z u 等f l l 】以澳洲野生稻( D 脚P ，f d 酗以仃凰) 为供体亲本，粳稻品种台中6 5 为 受体亲本建立了染色体片段导入系群体( C S I L ) 。K u b o 等【1 2 】利用回交翻分子标记 辅助选择方法，在粳稻品种A s o m i n o r i 的遗传背景上建立了批耥稻品种I 砒4 的 染色棒片段代换系( C S S D 。地l 等矧以粳型杂草稻移肇。箨恕谊磁。鸯蠡。0 走供 体亲本，利用S S R 标记构建了4 5 个以栽培稻M i l y 皴
6、啦3 为受体亲本的候选导入系 ( 1 己) 。氛e e 等以驻洲野生稻( 。张舞如秽磅W 1 9 4 4 隽供体亲本，剥用S S R 标记建 扬州人学硕士学位论文 6 立了3 6 个以韩国优良品种H w a y e o n 曲y e o 为遗传背景的导入系( I L ) 。刘冠明等翻利 雳徽卫星标记辅助选择建立了2 9 个以台中6 5 为遗传背景的S S S L 。上述研究者构 建的代换系群体一般只剩用1 个或少数几个供体亲本，且多数代换系存在多个代 换片段，由于其代换片段的来源比较单一，不利于进行Q T L 等位基因的分析。何 风华等人曾以6 个水稻品种为供体亲本，利用高代圆交和微卫星标记辅
7、助选择相 结合的方法，建立了8 6 个以华粳籼7 4 为受体亲本的S S S L ，对水稻基因组的覆盖 率为5 7 。1 嘲。在此基础上，曾瑞珍等f 蜘以另外1 2 个水稻品种为供体亲本，利用 回交和微卫星标记辅助选择相结合的方法构建了以优良粕稻品种华粳釉7 4 为遗 传背景的2 6 0 个不同的S S S L ，这些S S S L 代换片段豹总长度为5 ，6 6 1 0 e M ，对水稻 基因组的总覆盖率为8 3 8 。曾瑞珍所在实验室( 张桂权实验室) 已获褥了以华 粳籼7 4 为遗传背景的3 4 6 个S S S L ，代换片段的总长度为7 4 5 6 c M ，相当于水稻全 基因组总长
8、的4 7 倍，对水稻基因组的总覆盖率达9 3 2 ，其中对第2 、6 、7 、8 、 9 和1 0 染色体的覆盖率均已达1 0 0 。这些S S S L 的代换片段包含了水稻基因组丰富 的等位基因变异，可以利用这些等位基因变异来研究基因的功能。 1 1 3 单片段代换系建立过程中存在问题及展望 目前报道的代换系的建立过程中，存在很多问题【1 7 】。例如：建立的代换系群 体中大部分代换系仍含有多个代换片段，妨碍了这些代换系的进一步分析利用。 代换片段的分析为单片段代换系的建立奠定了基础。导入片段分析明确了各 个近等基因系代换片段的数翻和代换片段的具体位置，利用分子标记辅助选择， 可以在由各个近
9、等基因系与轮回亲本固交所构成的分离群体中选育出单片段代 换系，势开展Q T L 的鉴定和精细定位奠定了基础。曾瑞珍等【l8 l 用她们构建的单片 段代换系把控制粒宽的Q T LG w - 8 定位在第8 染色体长臂末端微卫星标记R M 5 0 2 与R M 4 4 7 之间，遗传距离均为O 3 c M ；同时把粒长Q T L9 1 3 定位于第3 染色体着丝 粒附近的微卫星标记壬U M 6 1 4 6 和P S M 3 7 7 之间，遗传距离分别为1 5 c M 和1 1 O c M 。 郝伟等i 1 9 】利用分子标记辅助选择技术构建了由1 3 3 个株系组成的以特青为轮回亲 本，以海南的一
10、种普通野生稻为供体亲本，覆盖绝大部分野生稻基因组的染色体 片段替换系。利用这套替换系，他们初步定位了控制稻米外观和理化品质性状的 1 5 个Q T 毛，为今后水稻品质性状Q T L 的克隆以及稻米品质相关性状的改良提供了 依据。 煲旭江构建染色体单片段叠代系，精细定位水稻2 个重鼹性状麟因 二 染色体单片段代换系大大促进了品种间代换系培育及利用品种间代换系进 行基毽研究工作的开展。采用培育单片段代换系的方法，可以有效遣将含有乡 源 染色体片段直接导入当地推广品种，培育叛品种或新材料，用予遗传研究或生产。 1 。2 抗水稻条绞时枯病基因研究进展 1 。2 。 水稻条纹升秸病的发生 水稻条纹叶桔病
11、( r i c es t r i p ed i s e a s e ) 是由水稻条纹病毒心c es t r i p e v i m s ，爻S V ) 弓| 起的病毒病，它的传毒介体主要是灰飞虱犯磊劬戤s 伊j I 勰 Z 船 F 越l e 妨。近几年随着免耕、稻套麦、麦套稻等轻型栽培技术以及感病高产晶种 的推广应用，传毒介体灰飞虱种群不断扩大，我国水稻条纹叶枯病的发生逐年加 重，尤其在江苏省水稻条纹叶枯病已成为罕见的重大爆发性病害，重病区的见病 面积占水稻种植面积的9 0 以上，病穴率高达7 0 9 0 ，严重的田块颗粒无收， 造成了巨大的经济损失f 捌。目前生产上主要通过改进栽培技术和适期
12、防虫治病相 结合的方法进行防治，但由予灰飞虱传毒的瞬时性和持久性，防虫治病十分困难， 悉且农药的使用会污染环境。因此，最经济有效的方法仍是选育优良的抗瘸晶种， 利用品种自身的抗性达到主动防治的目的。面目前的追切任务是挖掘新的抗条纹 叶枯病资源，并对其抗性特征进行研究，以便利用于水稻育种。 l ，晶秭对抗条纹叶桔病的影响：水稻品种对条纹叶桔病的抗性分为对病毒 的抗性、对介体灰飞虱的抗性或者对两者共同的抗性，根据发病率和症状严重度 可将对条纹病毒的抗性分成抗病毒侵染和被病毒侵染后对病毒的忍耐性【2 l 】。目前 我们江苏水稻种植的大部分是粳稻品种，大部分粳稻品种对条纹叶枯病是感病 的，而籼稻大部分
13、是抗病的。根据已有研究成果，粳稻的抗条纹叶桔病毒基因来 鲁釉稻或陆稻品种。一些研究者正在对籼稻晶种孛抗条纹时枯病基因进行精细定 位和克隆研究。本实验室也是利用一套籼粳杂交蜃代的叠代系对抗S w 基因进行 定位。 2 ，水稻条纹叶枯瘸的发病症状：该瘸是全株带毒的系统性病害，在水稻全 生育期均能发病，秧苗期和分蘖期最易感病，秧苗越小，感瘸的可能性越大，在 水稻幼穗分化期后很难感染和发病。 苗期发病：心叶基部出现褪绿黄白斑，后扩展成与时脉平行的黄色条纹，条 型H 本喾硕士掌位迨；L苎 纹闻仍保持绿色。粳稻品种表现为心叶黄自、柔软、卷曲下垂、成枯心状，战现 黄绿相闽条纹，分蘖减少，病株提早桔死。病毒病
14、弓| 起的桔心苗与螟虫为害造成 的话心苗相似，僵无蛀孔，无虫粪，不易拔起。 分蘖期发病：先在心时下一叶基部斑现褪绿黄斑，后扩展形成不规篓| j 黄白色 条斑，老叶不显症。粳稻品种表现为病株株高矮化1 5 2 0 e m ，并最终导致桔孕穗 或穗小畸形不结实。 拔节后发病：在剑叶下部出现黄绿色条纹，粳稻品种表现为不枯心，但抽穗 畸形，结实很少。 当R S V 浸染水稻后内部主要表现为：时肉细胞期维管束鞘细胞的叶绿体有不 同程度降解和淀粉粒累积，叶绿体数目减少，膜和片层不正常融合，些细胞有 不同程度的坏死；叶绿体中淀粉的过量积累可能引起了叶绿体的破坏，而后引起 褪绿斑的形成【2 2 私j 。病叶细
15、胞的细胞核增大，线粒体增多，细胞核和细胞质内有 大量小颗粒，可能是病毒粒体，而叶肉细胞、维管束鞘细胞和伴胞的细胞质和液 泡内有一些形状各异的不定形内含体，认为可能是& S V 侵染后所致韵病害特冥性 蛋自【2 5 也踟。 高泰东【2 9 l 在2 0 0 3 2 0 0 4 年的定点调查表明，水稻条纹时桔病在秧苗期主茎显 症后，同株的分蘖全部显症，病株死亡。分蘖期主茎显症后，同株的分蘖全部显 症；部分分蘖显症后，同株的主茎和其余分蘖全部显症，病株死亡或不成穗。拔 节期主茎显症后，同株的大部分分蘖( 6 8 9 7 9 2 ) 显症，部分茎、蘖( 3 2 9 2 3 0 ) 成穗，产量损失较大(
16、 8 0 8 ) ；部分分蘖显症后，同株的主茎不显症， 其余分蘖部分显症( 分蘖总显症率为5 3 O 6 6 7 ) ，全部主茎和部分分蘖成穗 ( 总成穗率6 1 重。4 8 。l ) ，产量损失较小( 3 4 5 ) 。病株不传染同穴健株。 3 ，传播介质灰飞虱：灰飞虱，同翅目，飞虱科。分布在中国各省，长江中 下游和华北发生多。寄主种类；灰飞虱的寄主种类很多，除危害一些禾本科佟物 外，还趋食禾本科杂革，其寄主常随季节性交化焉转移，有趋光、趋嫩绿和趋边 行的习性。为害特点：成、若虫刺吸水稻等寄主汁液，弓l 起黄叶或桔死。形态特 征：长翅型雌虫体长3 3 3 8 m m ，短翅型体长2 4 2 6 m m ，浅黄褐色至灰褐色，头 顶稍突出，长度略大于或等于两复眼之间的距离，额区具黑色纵沟( 条，额侧脊 吴旭江构建勰色体肇片段叠代系，精细定位水稻2 个重臻性状基因 9 呈弧形。前胸背板、触角浅黄色。小盾片中间黄白色至黄褐色，两侧各其半月形 褐色条
