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1、中国医科大学 硕士学位论文 术前术中持续输注谷氨酰胺对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响 姓名：崔凯 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：戴朝六 20040401 中文摘要 前言 肝脏缺血再灌注是外科I 晦床中常常遇到的问题，其不仅导致肝脏损伤， 还可引起全身多脏器功能不全甚至衰竭，严重的还可导致死亡。其确切机 制仍不十分清楚，一般认为与缺血期间的低氧损伤，再灌注期间血管内皮和 肝细胞损伤及继发于内皮细胞损伤的微循环障碍等有关。 而针对该损伤的防护，近年来已进行了大量的实验及临床研究，探索出 一系列方式方法，如缺血预处理等各种预处理；各种方式的分流或转流；枯 否氏细胞功能及凝血途径的抑制；针
2、对各种促炎性细胞因子的单克隆或多 克隆抗体，以及应用各种抗炎性细胞因子的重组物；还有各种药物保护。但 能够应用于临床的却很少。 谷氨酰胺( G i n ) 是一种条件必需氨基酸，近年来逐渐受到重视，广泛应 用于小肠相关疾病，骨髓移植，瘀胆和胆石症，创伤及肿瘤等多方面研究。 而在脏器缺血再灌注损伤方面，也应用于动物小肠及后肢模型的研究，证明 其对脏器有保护作用。本实验小组已证实，术前输入G i n 对大鼠肝脏缺血 再灌注损伤具有保护作用。但以上研究均是于术前给药，而F u k a t s u 等应 用小鼠小肠缺血再灌注损伤模型，采用术中缺血时静脉输入G i n 的方法，结 果证明作用反而是有害的
3、。但术前术中持续给药会对肝脏缺血再灌注损伤 产生如何影响，却未见相关报道。所以本实验应用大鼠肝脏缺血再灌注损 伤模型，采用从术前3 天开始直到缺血再寝注结束持续给药的方法，观察其 对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响。 但游离的G i n 不稳定，很难在溶解状态下长期保存。而丙氨酰- 谷氨酰 胺二肽( A h - G h ) 溶解度高、稳定性好，能耐受热灭菌，静脉输注后在二肽酶 作用下迅速分解成游离G l n 和丙氨酸。其和G l n 具有相同的维持血浆G l n 正常水平、改善氮平衡及小肠粘膜形态的作用。本实验即用A 1 a - G i n 代替 G l n 。 1 材料与方法 雄性W i s t
4、 a r 大鼠2 5 0 - 3 0 0 克，参照第三军医大学的静脉营养模型，行右 侧颈外静脉插管，微量泵输注0 9 N a c l 液，2 m l h ，观察1 天。然后大鼠随 机分为实验组与对照组，实验组给予3 A l a G l n ；对照组给予0 9 N a c l 液，速度均为2 m l h ，连续输注直到缺血再灌注结束。于插管后第四天开 腹，P r i n g l e 法建立门静脉淤血的肝脏缺血再灌注模型，至缺血4 0 分钟后去 除血管夹恢复肝脏血流，再灌注1 小时后分别自门静脉抽血2 m l ，鲎试剂比 浊法测定细菌内毒素( e n d o t o x i n ，E T ) ；自
5、主动脉抽血3 m l ，用全自动生化分 析仪测定动脉血清生化酶( 札1 ，A S T ，L D H ) 水平；取小块右叶肝组织，置于 1 0 中性福尔马林中固定，s p 免疫组化方法测定肝组织细胞间黏附分子 ( i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e - 1 ，I C A M 一1 ) 表达情况。血清内毒素，生化酶 的数值以i s 表示，t 检验方法进行统计学检验；肝组织I C A M - 1 结果用行 列表精确概率法进行统计学检验。所有数据资料均采用S P S S 软件进行 处理。P 0 0 5 ) 。 3 肝组织I C
6、 A M - l 表达：统计结果表明，肝缺血再灌注后I C A M - l 在肝 脏的表达，实验组较对照组明显增强( P 0 0 5 ) 3 I C A M 一1e x p r e s s i o no fl i v e rt i s s u e ：t h ed a t as h o w e dt h a tt h eI C 、A M 1e x - p r e s s i o no fe x p e r i m e n t a lg r o u pW a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dt h a nt h a to fc o n t r
7、 o l g r o u pa f t e rh e p a t i ci s e h e m i ar e p e r f u s i o n ( P 0 0 5 ) 。见表l 和图2 、3 、4 。 表1 门静脉血中内毒素( E U m 1 ) 及主动脉血中转氨酶( u D 水平( i s ，n = 7 ) - 1 4 图1 门静脉血中内霉索水半 图I 门静脉血中内毒素水平 圈2 主动脉血中转氨酶( A L T ) 水平 图2 主动脉血中转氨M ( h L T ) 7 9 习z 1 5 刚3 主动脉血中转氨酶( A S T ) 水平 图3 主动脉血中转氨酶C A S T ) 水平 图4 主
8、动脉血中转氨酶C L D H ) 水平 图4 主动脉血中乳酸脱氢酶( L D H ) 水平 1 6 3 肝组织I C A M l 表达：I C A M - 1 的阳性染色为棕黄色颗粒，定位于胞 浆或胞膜。实验组：中央静脉管壁及周围部分肝细胞深染，窦内皮细胞及枯 否氏细胞亦可见强表达。对照组：中央静脉管壁及周围肝细胞淡染，内皮细 胞及枯否氏细胞可见微弱表达。见表2 和图5 、图6 。 阳性表达情况以阳性细胞面积 6 0 为槲。统计结果表明，肝缺血再灌注后I C A M 一1 在肝脏的表达，实 验组较对照组明显增强( P 0 0 5 ) 。 表2 肝组织I C A M 一1 分子表达( 例) X
9、2 - - 8 2 4 2 P 0 0 5 图5 实验组：中央静脉管壁及周围部分肝细胞深染，内皮细胞及枯否氏细 胞亦可见I C A M 一1 强表达。 1 7 图6 对照组：中央静脉管壁及周围肝细胞淡染，内皮细胞及枯否氏细胞可 见I C A M l 的微弱表达。 讨论 G i n 是机体内含量最为丰富的氨基酸之一，约占体内游离氨基酸的 6 0 以上，它是体内物质代谢的一个重要的中间产物，是快速生长细胞如肠 粘膜细胞、淋巴细胞、肾小管上皮细胞等的重要代谢物质1 。手术创伤后， 机体分解代谢加速，合成代谢下降，呈负氮平衡。在这种应激状态下，由于 骨骼肌蛋白分解代谢的增强，释放出大量G l n ，使
10、机体G i n 库被大量消耗，与 此同时其它组织器官特别是小肠对血中G i n 的摄入增加，反而使血浆G i n 浓度下降，因此，在创伤应激状态下，机体对G i n 的需要量大大增加了。此 时，补充外源性G i n 是有益的，能减少蛋白分解，促进蛋白合成，改善氮平 衡，保持肠道粘膜的完整性，防止其萎缩，可提高血浆G l n 浓度，维持胃肠屏 障功能，减少细菌和毒素的移位H “，从而对组织损伤起到保护作用。 多数研究u “1 3 1 表明，外源性G i n 主要是通过提供谷氨酸组分，增加组 - 1 8 织中谷胱甘肽含量而减轻细麒脂质过氧化，增强组织清除反应性氧中间 产物的能力，减少毒性细胞成_
11、分向器官或直循环中释放，从而对器官损伤起 到保护作用的。而在P r e m 等【2 1 的大鼠后肢缺血再蘧注损伤模型中，腹腔注 射G i n 并没有使受损肌肉组织中谷胱甘肽含量增加，他们认为该模型中G i n 对减轻损伤可能有一个更直接的作用，如帮助维持足够的细胞内能量如 A T P 水平而不是增强谷胱甘肽系统。 另外，G i n 还可通过其它途径发挥对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。 如增加细胞膜的稳定性，亦可调节永盐代谢，防止细胞内外水肿的发生雌“； 能刺激肝糖原生成，提高肝细脆糖原储备；G i n 还是瞟呤、嘧啶、核酸等合成 的重要底物和前体，可提高生长激素水平，促进生物大分子合成以及创伤
12、恢 复；G i n 还可通过保护肠道屏障功能，防止细菌毒素及细胞因子移位激活肝 枯否氏细胞等而发挥对肝脏的间接保护作用。 本实验采用从术前3 天开始直到缺血再蓬注结束持续给药的方法，结 果表明实验组E T 、A L T 、I C A M - 1 三项指标均显著高于对照组，而A S T 及 L D H 水平两组间无显著炷差异，说明该方法给药对大鼠肝脏缺血再灌注损 伤可能是有害的。 内毒素是由蛋白质、类脂、多糖组成的异质多聚体，多见于革兰氏阴性 杆菌和球菌，其主要成份脂多糖( L P S ) 是类脂和多糖的复合体，L P S 具有广 泛的生物活性。门静脉淤血时，肠黏膜通透性增加，屏障功能减弱，导致
13、细 菌内毒素移位至门静脉血中。面l 萨是维持黏膜免疫功毹及屏障完整性的 重要组成成分，其占机体免疫球蛋白总量的5 0 t l s 。在动物模型，肠道 l 鼬水平与细菌生长、移位及肠道通透性成负相关惮- 1 ”。m 4 和I L - I O 毹够 促进I g A 的合成u 卜驯，而术前静脉输入G i n 可以维持m 4 和I L - I O 的表达 从而促进l g A 的合成以保护肠黏膜屏障辟啦3 。本实验中实验组较对照组 E - r 水平升高，说明肠屏障功链减弱，是否因为术中输入的C A n 改变了对I l 业 的调节机铜，抵消了术前输入的G i n 所起的作用，甚而减弱了肠屏障功能， 从而导
14、致内毒素移位增加，有待进一步研究证实。F u k a t s u 等峥认为，G i n 是瑚N s ，淋巴细胞及巨噬细胞的重要养料旧j ，早期投人可能通过激活 P M N s 面加速损伤的发生，其可能主要增强了过度的炎症反应而并没有保 护肠道屏障或调节促炎性细胞因子反应。 I C A M l 属于细胞黏附分子中的免疫球蛋白超家族，在正常肝组织中， 内皮细胞和枯否氏细胞有低水平的I C A ! 一l 表达。但是，在缺血再灌注下， 1 9 由于组织缺氧、微血栓形成、肠源性内毒素释放入血引起循环中的内皮素、 血小板活化因子( P A F ) 、细胞因子( 如I L - 1 、I L - 6 、I L
15、 - 8 、T N F ) 浓度升高，而这 些因子将会上调血管内皮细胞表面I C A M - 1 的表达。本实验中实验组较对 照组肝组织I C A M 一1 表达增强，一方面可能为肠道屏障功能减弱，导致各种 毒性成分入肝，进一步激活枯否氏细胞，使其产生毒性产物如T N F 增加，而 后者可明显上调肝血管内皮细胞及肝细胞I C A M - 1 的表达J 。另一方面原 因可能是提供外源性G l n 可使机体内产氨增加，正常生理情况下肝脏可将 血氨转化成尿索而解毒，而本实验模型必会导致肝功能障碍，过量的氨必 会增加对肝脏的毒性，使其损伤加重，亦可能导致I C A M 一1 的表达上调。 结论 总之，
16、本实验结果表明，术前至术中持续静脉输入G l n 对肝脏缺血再灌 注损伤可能是有害的。是否因为术中输入的G i n 改变了对I g A 的调节机 制，抵消了术前输入的G l n 所起的作用，甚而减弱了肠屏障功能，从而导致 内毒素等毒性产物移位增加，进而使肝脏I C A M - 1 表达增强，目前仍不清 楚；另一方面，提供外源性G i n 可使氨的产生增加，从而加重了受损肝脏的 负担，使其损伤加重，亦可能导致I C A M 一1 的表达上调。这些假说有待进一 步实验证明。给药时机不同可导致截然不同的结局，把握恰当的给药时机 是发挥G l n 重要作用的关键。 2 0 本研究新见解 术前投予G i n 对脏器缺血再灌注损伤有保护作用，但缺血再灌注过程 中仍继续给药反而起有害作用。因此，把握恰当的给药时机对发挥G i n 的 作用非常重要。 - 2 l 参考文献 1 I k e d aS ，Z a r z a u rB L ，J o h n s o nC D 。e
