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1、Yi4。e7a8分类子：R73053UDC616-0064窑级：公开编号+04111048咿幽巍毋博士学位论文棉酚衍生物ApoG2抗人淋巴瘤细胞作用及作用机理的研究学位中请人导师姓名厦职称孙健姜文奇教授肿瘤学棉酚衍生物ApoG2抗人淋巴瘤细胞作用及作用机理的研究【研究背景与目的】专业肿瘤学博士生孙健导师姜文奇教授中文摘要恶性淋巴瘤是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统恶性疾病之一，也是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一。恶性淋巴瘤的病因，包括病毒感染、环境因素、化学因素等，目前倾向于多种因素作用的结果。现已知抗肿瘤药物多是通过诱导细胞凋亡而清除肿瘤细胞的。Bcl2基因家族是细胞凋
2、亡的重要调控基因，所编码的蛋白通常被分为抗凋亡蛋白(如Bcl2和BclxL)和促凋亡蛋白(如Bak和Bax等)，广泛表达于血液淋巴系统的肿瘤细胞，并对恶性淋巴瘤的发生和发展起着重要的作用。Bcl2蛋白的活性受其Bax调节，Bax能自身形成同源二聚体(BardBax)而诱导凋亡，Bcl2可与Bax形成异源二聚体(Bcl2Bax)以抑制凋亡。BclxL是Bcl2家族的主要调节凋亡抑制因子，鉴于Bcl2和BclxL蛋白对于抑制肿瘤细胞凋亡中所起的重要作用，人们尝试将其作为肿瘤治疗分子靶点。Mcl1蛋白是一类，与-Bcl2蛋白质具有35的同源性的蛋白质，Mcl1在许多细胞凋亡过程中表达下调，Caspa
3、se介导的对Mcl1的分解可能是其表达下调的主要原因。研究表明Mcl1在B细胞非何杰金淋巴瘤(BNHL)中表达上调，并且与BNHL的恶性程度呈正相关，Mcl1主要表达于高度恶性组，在低度恶性组中为弱表达或阴性表达。因此Mcl1在BNHL的发生、发展以及生物学行为中具有重要作用。凋亡缺陷可以导致恶性肿瘤的发生和发展，转基因小鼠Mcl1过表达导致淋巴瘤发病率增加，表明Mcl1可以直接导致恶性肿瘤的发生。Mcl1在人类恶性肿瘤细胞广泛表达，越来越多的研究表明Mcl1在临床疾病中是一个有效的预后预测指标。为难治性肿瘤的治疗开辟了一条新途径。提供药物干预的靶点，可开发研制抗肿瘤新药。所以Mcl1是未来新
4、的抗癌治疗策略中一个新的靶点。棉酚是非甾体男用口服避孕药物，研究发现棉酚除具有抗生育、抑制寄生生物体生长和抗病毒(包括HIV病毒)的作用外，还具有抗肿瘤作用。有关棉酚抗肿瘤作用的报道，其中涉及对黑色素瘤、结肠癌细胞、Ehrlich腹水瘤、P388、L1210鼠白血病、SW-13。肾上腺皮质肿瘤、鼠红白血病细胞(克隆6A11A)、人神经胶质瘤细胞株(HS683，U373，U87，U138)、乳腺癌MCF7(敏感株和耐药株)、黑色素细胞株(SKmel19和SKmel28)、白血病HL60、乳腺癌细胞株T47D、卵巢癌OVCAR3、结肠癌HT-29和LoVo、转移性MATLyLun开i癌细胞等多种细
5、胞具有增殖抑制或抗转移活性。临床试验也已证实棉酚对转移性肾上腺肿瘤，神经胶质瘤和难治性转移性乳癌具有疗效。荧光偏振技术的研究发现棉酚具有结合Bcl一2$1BclxL蛋白的能力，为避免两个醛基带来的非特异性毒性，设计合成-jApoG2，ApoG2已被证实可以有效地与Mcl1SEIBcl2蛋白结合，并具有良好的稳定性，可以对抗酸，碱，光照和过氧化物。由于ApoG2是全新改造的化合物，有关的ApoG2用于抗肿瘤研究尚未有报道，将ApoG2用于恶性淋巴瘤的研究在国内外也属于空白，因此是一个崭新的领域。本研究的目的是：将ApoG2用于恶性淋巴瘤细胞的研究。研究ApoG2体外对外抗淋巴瘤细胞的增殖作用，并
6、研究其诱导淋巴瘤细胞凋亡的机理。【方法与结果】第一章：Bcl-2家族蛋白在Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞中的表达；方法：取对数生长期的Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞，提取细胞总蛋白，进行蛋白定量，westernblot法测定Bcl2、Bax及BclxL蛋白的表达。结果：Bcl一2蛋白在除Ramos细胞外的Namalwa、Jurkat、U937及Raji细胞均有表达；Bax蛋白在除Namalwa细胞外的R_amos、Jurkat、U937及Raji细胞均有表达；Bcl-xL及Mcl1蛋白在Ramos、Namalwa、
7、Jurkat、U937及Raji五种细胞均有表达。第二章：ApoG2对Ramos、Namalwa、Jurkat、U937及Raji淋巴瘤细胞株的体外抗增殖活性；方法：取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，设ApoG2不同的浓度及相应的溶剂对照组。采用CCK8法测定每TLOD值，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50值)。结果：ApoG2对以上5种淋巴瘤细胞均有增殖抑制作用，显示出良好的抗肿瘤活性。IC50值分别为：Ramos细胞：954+1011aM；Namalwa细胞：984+085I-tM；Jurkat细胞：849_+0569M：U937细胞：9261769M；Raji细胞：982087I
8、tM。进一步检测了不同作用时间下ApoG2对U937细胞的生长抑制作用的影响，发现随ApoG2对U937细胞的抑制作用随时间的延长而加大；其24h、48h和72h的IC50值分别为30080569M，1481176“M和9261769M。第三章：ApoG2对U937细胞周期及相关的细胞周期调控蛋白的影响；31流式细胞仪检测细胞周期分布方法：收集不同浓度ApoG2处理的U937细胞，采用流式细胞仪检NDNA的含量，LYSIS软件分析。结果：不同剂量ApoG2分别作用U937细胞12h后，细胞出现不同程度的Gl期阻滞，呈剂量依赖性。32Westernblot法检测细胞周期调控蛋白的表达情况方法：不
9、同浓度的ApoG2分别处L里U937细胞12h、24h署f148h后，及用10uM分别作用于U937细胞6h、12h、24h和48h，收集细胞，提取总蛋白，定量。用等量蛋白进SDSPAGE电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗，二抗，暗室中曝光，冲片。Ill结果：(1)101aMffApoG2分别作用于U937细胞6h、12h、24h、48h后，P21蛋白表达量与对照组相比呈升高趋势，于24h表达升至最高，48h的表达量下降；CyclinE蛋白的表达量与对照组相比呈下调趋势，于12h表达降至最低；CyclinD1蛋白的表达量与对照组相比呈下调趋势，于12h表达降至最低；Cmyc蛋白的表达量与对照
10、组相比呈下调趋势，于48h表达降至最低。(2)不同剂量(5、10、201aM)的ApoG2分别作用于U937细胞12h，24h和48h后：P21蛋白：12h后的P21蛋白表达水平与对照组相比无明显变化；24h后的P21蛋白表达随药物剂量升高呈剂量依赖性上调；48h后的P21蛋白的表达随药物剂量(5、10、20tM)升高而上调。CyclinE蛋白：12h后的表达未成明显的剂量依赖性下调，其水平与对照组相比表达减少；24h及48h后的蛋白表达量均随药物剂量升高呈明显的剂量依赖性下调。CyclinD1蛋白：12h，24h及48h后的表达量与对照组相比表达减少，均呈明显的剂量依赖性下调趋势。Cmyc蛋
11、白：12h，24h及48h后的表达量与对照组相比表达减少，均呈明显的剂量依赖性下调趋势。第四章：ApoG2诱导U937细胞凋亡及机理研究。41流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪分析显示，U937细胞经不同剂量ApoG2分别处理12h、24h、48h后，有不同程度的亚Gl峰(凋亡峰)出现，并呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。42DNA梯形条带检测用细胞凋亡DNAladder检测试剂盒检测发现，ApoG2处理后的细胞在DNA琼脂糖凝胶电泳图谱上出现特征性的梯形条带。43荧光显微镜观察凋亡小体IV不同浓度的ApoG2分别处理U937细胞48h后，DAPI染色结果：对照组细胞核形态完整、染色均匀，10uM
12、ApoG2处理U937细胞48h后，细胞核出现浓缩、颗粒化并有凋亡小体出现，随着药物处理剂量增大细胞核破坏更加明显。44Caspase一3、Caspase-9活性检测及Caspase一3蛋白的表达经ApoG2处理U937细胞12h后，细胞中Caspase3和Caspase一9的活性明显升高且呈剂量依赖性。U937细胞在经10uM的ApoG2分别作用6h、12h和24h后，procaspase一3的活性断裂片段随作用时间而增多。45ApoG2对U937细胞中Bcl2、Bax、BclxL及Mcl1蛋白表达的影响Westemblot分析显示10uMApoG2作用于U937细胞后，BclxL蛋白的表达
13、随作用时间的延长而下调；彳Qo一芝芑n-9moEco寸肖03IeQo一=一芑西毋Qo鱼!些!图4-5ApoG2对U937细胞中cp私e0蛋白表达的影响Fig4-5EffectofApoG2onthelevelofproteinCaspase3inU937cellsU937cellswefetxeatedwithlOl_tMApoG2for6h12hand24hrespectivelyWestemblotanalysiswasperedwithmonoclonalanti-casDase一3antibody01箜!U!H丛26h12h24h卜GAPDH鱼!鲤!i二!g!图4-6ApoG2对U93
14、7细咆Bcl一2，B&x，BclxL蛋白表达水平的影响Fig4-6EffectofApoG2onthelevelofproteinBcl一2BaxandBcl-xLinU937cellsU937cellsweretreatedwithtogMAp002for12h24hand4Sb(A)U937cellsweretreatedwith5，10，20，40uMApoG2respectivelyfor48b(B)WesternblotanalysiswasperedwithmonoclonalantiBcl一2，BaxandBcI-xLantibodyDoG2(10pM)012h24h48h-。叫
15、nBcl一2II_一IIIII-+“一_一j-GAPDH(A)却oG2(48IllCl州51020柏(10pM一Bd2_-Bax-I叫+GAPDH(B)垒!鲤!i二!图47ApoG2对U937细胞Mcl-I蛋白表达水平的影响Fig4-7EffectofApoG2onthelevelofproteinMclIinU937cellsU937cellsweretreatedwith10mApoG2for6h，12h，24hand48h(A)U937cellswereeatedwith5，10，20uMApoG2respectivelyforl2h，24hand48h(B)WestemblotanalysiswasveredwithmonoclonalantiMcl一1antibodyAooG2(10uMControl5102012h(A)一Mc|1_GAPDH一Mel一1-_I，-I_GAPDH(B)尘!E坚i!图4-8ApoG2对U937细胞中Bcl一2家族蛋白相互作用的影响Fig4-8EffectofinteractionsbetweenBcl一2familyproteinsinU937cellsbyApoG2InteractionsbetweenBa
