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1、福建医科大学 硕士学位论文 树突状细胞在结核病免疫中的作用及机制 姓名：黄家禹 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：宋秀宇 20100301 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 树突状细胞在结核病免疫中的作用及机制 摘要 目的 研究树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l ，D C ) 在不同结核病患者中的含量及成熟度变 化，探讨D C 在结核病免疫中的作用机制，为基于D C 的新型结核疫苗开发和抗 结核免疫治疗方案提供实验依据。 方法 1 抽取结核病患者外周血，以三色标记流式细胞术( F C M ) 测定外周血D C 含量。 2 分
2、离出外周血单个核细胞进行D C 体外诱导培养，加入r h G M C S F 、 r h l L - 4 、r h T N F 一0 【联合诱导培养11 天收获细胞。 3 用倒置显微镜、扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞外部形态和 内部超微结构。 4 荧光定量P C R ( R T P C R ) 检测细胞I L 一1 2 p 4 0 、I L 1 2 p 3 5 和C C R 7m R N A 表达情况。 5 酶联免疫吸附试验( E L I S A ) 检测细胞培养上清液I L - 1 2 p 7 0 含量。 结果 1 结核病患者组外周血D C 总数和D C l 亚群分别为( 0 4 2
3、 士0 1 9 ) ， ( 0 2 8 士0 1 3 ) ，均显著低于正常健康对照组，其差别具有统计学意义( P 0 0 5 ； 1 9 孚v如u口 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 2 2D C 形态学观察结果 2 2 1 倒置显微镜下D C 的形态 采用粘附培养4 小时的方法，从单个核细胞中分离出来的贴壁细胞呈圆形， 主要为单核细胞；加入r h G M C S F 、r h l L 4 培养2 4 小时后开始出现少量半悬浮 状态细胞，大部分仍呈贴壁生长，形态未见异常，4 8 小时后呈半悬浮状态的细 胞开始增多，但未见细胞表面有明显的突起，3 4 天可见部分细胞呈梭形
4、或不规 则形状，4 6 天开始出现成簇现象，散在分布于培养板中；加入r h T N F Q 或L P S 后，成簇现象明显增多，可以见到形状不规则、带有毛刺状突起的悬浮细胞，随 着时间的延长，成簇的细胞团散开，在培养1 1 天时即可以看到细胞表面有明显 的毛刺状突起，即为具有典型D C 形态的悬浮细胞( 图5 图1 8 ) 。 2 2 2 扫描电镜下D C 形态 扫描电镜下可见D C 形态不规则，胞体突起呈粗细不等的树枝状，有的突起 末梢呈球状膨大，细胞表面粗糙，而且有层叠状的褶皱( 图1 9 图2 0 ) 。 2 2 3 透射电镜下D C 形态 透射电镜下可见结核病患者组D C 形态不规则，
5、表面有大量粗细不等的树枝 状突起，细胞核清晰，胞浆内线粒体丰富，粗面内质网发达，溶酶体可见；正常 对照组D C 表面也可见树枝状突起，但突起较少，胞浆内溶酶体、粗面内质网数 量极少或无( 图2 1 图2 2 ) 。 2 0 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕 毕业论文 图5 患者组培养第3 天光镜下形杏( x 2 倍) n 5T h ec e B u i n r m o r p h o l o g y o f p e t i n m t s w i t h t h h e r c u l o s i s i n l j g h t m i c r o s c o p e o D t
6、 h e 3 “d a y ( x 2 0 0 ) 图7 意者组培养第5 天光镜下形态( x 2 0 0 倍1 F i g 7 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f p a t i e n t s w i t h t u b e K u l o s i s i nU g h t m i c r o s c o p e o t h e 5 d a y ( x 2 0 0 ) 圈6 对照组培养第3 天光镜下形志( 2 倍) F i g 6 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g yo f c o a t r
7、o l g r o u p i nU g U t m i c r o s c o p eo n t h e 3 “d a y ( x 2 0 0 ) 图S 对照组培养第5 天光锛下形蠢( x 2 帅倍) F 嘻8 T h ec e l l u l a rm o r p l l o l o g yo f c o n t r o lg r o u p i n l i g h t m i c r o s c o p e o D t h e 严d a y x 2 l 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 图9 患者组培养第7 天光铸下形志( x 2 0 0 倍)圈1 0 对照组培养
8、第7 天光甓下搿卷( x 2 0 0 倍) F 幢9T h e c e l l u l a r m o r p h o l o g yo f p a t i e n t s w i t h t n b e 代u I bi nl i g h tm k r e d c o p e 删t h e7 d a y ( x 2 0 0 ) F 疃1 0 T h ec e n e l a r m o r p h o l o g yo f e o n t r o lg r o u p l i g h t m i c r o s c o p e O B t h e 7 “d a y f x 2 0 m 圈I l
9、 患者组培菲第9 天光镜下形舂( x 2 0 倍)圈1 2 对照组培养第9 天光键下形吝( x 2 0 0 倍) F i 蛋1 IT h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f p a t i e n t s w 油 t u b e r e u l t H i s i n l i g h t m l e r o “ o p eo n t h e 9 d a y ( x 2 0 0 ) r i g 1 2 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g yo f c o n t r o l g r o u p m I 蚺I
10、c m p eo R t h e 矿d a y ( x 2 0 0 ) 霾 霾 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 圈”患者组培养第9 天光镜下形态p 4 倍) F i g 1 3T h e c e l l u l a r m o r p b o l o l d o f p a t i e n t s w i t h t u b e n l 口m i n l i I e h t m i c r o s c o p eo n t h e 9 d a y f x l 圈1 5 患者组培养第1 1 天光镜下形杏( x 2 0 0 倍) F i g I ST h ec e l l
11、 u l a r m o r p b o l o g ) “ o f p a t i e n t s w i t h t u b e r c u l o s i s mU g h t m i c r o s c o p e t h e l l d a y ( x 2 0 0 ) 圈对照组培养第9 天光镜下形态( x 柚0 倍) F i g 1 4 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f c o n t r o lg r o u p i n l i g u t m i c r o d c o p to D t h e9 d a yr x m 图1
12、 6 对照组培养第天光镜下形杏( x 2 倍) F 蜒1 6 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f c o n t r o l g r o u p hu g h t m i c r o s c o p e o n t h e l l d s y ( 。2 ) 福建医科大学l 临床检验诠断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 圈1 7 患者组培养第l l 天光镜下形杏( x 4 0 0 倍) r l 1 7 T h ec e l l n l a r m o r p h o l o g yo f p a t i e n t s w i t h t u
13、 b e r c u t o s i s i n l i g h t m i c r m c o p e o Bt h e1 1 d a y ( x 4 0 0 ) 鞭 栉 r。 圈t 8 对照缎培养第1 1 天光镜下形态( x 4 e e 倍) F 嘻1 8 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g yo f c o n t r o l g r o u p i n l i g h t m i c r o s c o p eo B t h e l l d a y ( x 4 0 0 ) 图1 9 患者组培养第l l 夭扫描电镜下细胞 形志( x 1 0 ,
14、0 0 e 倍1 F i g 1 9 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f p a t i e n t s w i f l t t u b e t _ c n l o s b I n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e o n t h e l l d a y p l 仉帅0 l 图2 0 对照组培养第1 1 天扫描电镜下细臆 形春( x 1 0 , 0 0 0 倍) F i 晷2 0 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f c
15、 o n t r o l g r o u p i n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e o m t h e l l d a y ( x 1 0 , 0 e 0 ) 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 图2 1 患者组培养第1 l 天迸射电镜下 细胞形志( x 1 0 , 0 0 0 倍l F 吨2 1 T h ec e l l u l a r m o r p h o l o g y o f p a t i e n t a w R h t u b e r c u l o s i si nt r a n s
16、 m i s s i o ne l e c t r o nm i c r 嗍口p c o H t h e l l d a y ( x l O , 0 0 0 ) 圈2 2 对照组培养第1 1 天透射电下 细胞形寿( x 1 0 o 倍) F 唾2 2 T h ec e u L I r m o r p h o l o g yo f c o n t r o l g r o u pi nt r l n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p eO Bt h e 1 1 d 曩y ( x 1 0 , 0 0 0 ) 福建医科大学临床检验诊断学2 0 0 7 级硕士毕业论文 2 3IL - 12 p 4 0 、IL - 12 p 3 5 、C C R 7m R N A 表达水平检测 2 3 1 细胞总R N A 提取结果 取5 I 总R N A 经紫外分光光度
