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1、, g l tN 科大学 18 117 11 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 躲即币签恻：一芗 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果
2、，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：搠# N I I I 章珐 & D 口 日 C，一 Z 月 一 ，o 吖年 目录 肿I II ff l f I FI fJ l f l ff l l lf l l l ll l l I 18 0 0 3 3 4 中文摘要O OOOOO OOO 1 英文摘要O O O OOO O OOIOOOO I 3 英文缩写8 研究论文正中隆起室管膜细胞在高血压大鼠的形态学改变 前言“9月U 蟊”一”“”“”一”一”一”“”一”。9 材料与方法O OO OOO 1 0 结果- 1 6 附图O O OOOO 1 9 附表- ”3 5 讨
3、念O O oOO ”oO OOO - 3 6 参考文献4 1 综述高血压动物模型的研究进展4 4 致谓 5 9 个人简历6 0 中文摘要 正中隆起室管膜细胞在高血压大鼠的形态学改变 摘要 目的：观察高血压大鼠正中隆起室管膜细胞在不同时期的形态学变 化。 方法：选择健康雄性W l s t a r 大鼠6 0 只，体重2 0 0 9 2 5 0 9 ，随机分为 五组：对照组( n = 1 2 ) ：不做任何处理；用药l 周组( n = 1 2 ) ；用 药2 周组( n - 1 2 ) ；用药3 周组( n _ 1 2 ) ；用药4 周组( n - 1 2 ) 。 l 高血压模型制备：实验动物予以
4、一氧化氮合酶抑制剂一左旋硝基精氨 酸( L N N A ) 1 5m g d k g ，分别于8 ：0 0 A M 、8 ：0 0P M 两次腹腔注射，制 备高血压动物模型。 2 光镜标本制备：常规经心灌注、固定、取脑，常规石蜡包埋，连续石 蜡切片，片厚5 u m 。常规H E 染色、n e s t i n 免疫组化染色、封片。显微镜 观察、照相。 3 电镜标本制备：麻醉、灌注同光镜标本制备，但灌注液为含2 多聚 甲醛和2 5 戊二醛的混合磷酸缓冲液。取包含M E 的脑块用P B S 冲洗， 梯度酒精脱水，叔丁醇置换，真空干燥、喷金，日立S 3 5 0 0 N 观察、照 相。透射电镜样品制备与
5、扫描电镜样品制备相同，取下M E ，放入4 戊 二醛固定，1 饿酸后固定，树脂包埋，切片，T - $ 7 5 0 0 透射电镜观察、照 相。 4 统计学处理：N e s t i n 阳性细胞采用麦克奥迪数码医学图像分析系统 ( M o t i cM e d 6 0 ) 测定灰度值。数据用均数加减标准差( 汹) 表示。应用 S N K q 检验，进行两两比较，以P 1 4 0 9 0 m m H g 时为高血 压。 2 3 光镜标本制备 2 3 1 取材、标本制备 实验动物给予1 0 水合氯醛按0 3 m Y l 0 0 9 体重麻醉后，经左心室灌 注3 7 预热的生理盐水2 0 0 - - 2
6、 5 0 毫升，后灌注4 4 多聚甲醛3 0 0 毫升 ( 先快后慢，3 0 - 4 0 分钟内灌注完毕) ，取脑后立刻将脑组织放入4 多聚甲 研究论文 醛后固定8 小时。后固定结束后将组织块蒸馏水冲洗后放入6 0 、7 0 、 8 0 、9 0 、9 5 酒精中各4 小时，10 0 酒精2 次各2 小时，二甲苯2 次各l 小时，6 2 下浸蜡2 次各1 小时。包埋，修块，标记后放入4 。C 冰 箱中备用。参照大鼠脑切片图谱，常规石蜡切片，片厚5 9 m ，用A P E S 处理过的载玻片捞取后，置于3 7 烤箱中烤2 4 4 8 小时。烤好的切片放入 切片盒中，入4 。C 冰箱或室温保存备用
7、。 2 3 2H E 染色步骤 取上述切片： 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，自来水水化5 分钟。 苏木精( 米氏) 染色室温下15 m i n 。 1 盐酸酒精分化数秒。 自来水返蓝5 分钟。 O 5 伊红染色3 r a i n ，自来水洗数秒。 6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 、无水酒精I 、无水酒精I I 梯度酒 精脱水各5 分钟。 二甲苯透明两次，每次5 分钟。 中性树胶封片，O l y m p u s 万能照相机观察照像。 2 4 免疫组织化学染色 ( 1 ) 取上述H E 染色的相邻切片，常规脱蜡，经各级乙醇至水：二 甲苯( I ) 5 m i n - - - Z 甲
8、苯( I I ) 5 m i n - - - 1 0 0 乙醇5 m i n - - - 9 5 乙醇5 m i n - - 8 0 乙醇5 m i n - - - 7 0 乙醇5 m i n _ 蒸馏水洗5 m i n 。 ( 2 ) 0 0 1 MP H = 7 4P B S 浸泡5 m i n 。 ( 3 ) 封闭内源性过氧化物酶：切片入0 3 甲醇过氧化氢室温下孵 育2 0m i n 。然后以蒸馏水清洗，清洗3 次，每次5 m i n 。 ( 4 ) 抗原修复：将切片浸入枸橼酸缓冲液( P H 6 0 ) ，在免疫组化专 用微波炉中进行微波修复，9 8 2 0 分钟，室温下自然冷却后，
9、0 0 1 M 的 P B S 洗3 次，每次5 m i n 。 ( 5 ) 封闭非特异抗原：1 0 山羊血清封闭，3 7 。C 温箱湿盒内孵育3 0 m i n 。 ( 6 ) 加入一抗：滤纸吸去多余血清，加入一抗，即兔抗大鼠I g G ( 稀 释1 ：1 0 0 ) ，4 。C 冰箱孵育过夜。 研究论文 ( 7 ) 0 0 1 MP H = 7 4P B S 冲洗3 次，每次5 m i n 。 ( 8 ) 加入二抗：加入生物素化羊抗兔I g G ，3 7 。C 温箱湿盒内孵育3 0 m i n 。 ( 9 ) 0 0 1 MP H = 7 4P B S 冲洗3 次，每次5 m i n 。
10、( 1 0 ) 加入三抗：滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，3 7 。C 温箱湿盒内孵育3 0 m i n 。 ( 11 ) 0 0 1 MP H = 7 4P B S 冲洗3 次，每次5 m i n 。 ( 1 2 ) D A B 显色：室温下D A B 显色2 5 m i n 。 ( 1 3 ) 自来水充分冲洗，终止显色。 ( 1 4 ) 梯度酒精脱水：7 0 ，8 0 ，9 0 酒5 m i n ，9 5 酒精1 0m i n ， 1o o 酒精I 、I I 各15 m i n 。 ( 15 ) 二甲苯I 、I I 、I I I 各15 m i n 透明。 ( 1 6 ) 中性树胶
11、封固。 阴性对照用P B S 替代一抗，其余步骤同上。O l y m p u s 万能照 相机观察照像。 2 5 图像分析 选取1 0 x 4 0 倍视野调整好显微镜的光源强度使之保持不变，对正中 隆起进行扫描。扫描过程中保持四个固定，即显微镜的光源强度固定； 暴光数固定；白平衡值固定；视场域大小固定。每只大鼠具有以上 部位的切片各选5 张，每张切片选以上部位结构清楚的5 个阳性细胞进行 画分割，然后选取平均灰度值这个参数进行测量，计算机直接得到这项指 标的平均值。平均灰度值反应组织、细胞的明暗，间接反应所含化学物质 的多少，数值越大表明含量越少。 2 6 扫描电镜 2 6 1 扫描电镜标本取
12、材 灌注固定方法同前述。固定液为混合固定液( 含2 多聚甲醛和2 5 戊二醛) 3 0 0 m l 。灌注完毕后取脑，放入2 戊二醛中后固定。按下述 步骤切取相应脑块。 正中隆起取材过程如下：从2 戊二醛中取出脑块，用P B S ( 三蒸水配 置) 冲洗3 遍，去除软膜。在视交叉及垂体柄水平方向用刀片垂直切入 2 m m ，两者之间即为正中隆起。再沿正中隆起两侧l m m 矢状方向斜向内 研究论文 侧切入2 m m ，即可将正中隆起取下。放入盛有P B S 的小玻璃瓶中轻轻摇 晃，冲洗3 次去除残留在正中隆起中的戊二醛。将样品块放入盛有P B S 小瓶中送电镜室制备电镜标本。 2 6 2 扫描
13、电镜标本的制备 准备好的标本行梯度酒精脱水，5 0 乙醇1 0 m i n - - * 6 0o 6 乙醇 1 0 m i n - - , 7 0 乙醇1 0 m i n - - 8 0 乙醇1 0 m i n - - - 9 0 乙醇1 0 m i n - - , 9 5 乙醇 1 0 m i n - * 1 0 0 乙醇1 0 m i n - * 7 5 叔丁醇1 0 m i n 一1 0 0 叔丁醇1 0 m i n _ 叔 丁醇封存。抽真空、喷金，行H 3 5 0 0 S 型扫描电镜观察。 2 7 透射电镜 2 7 1 透射电镜标本取材 灌注固定方法同前述。固定液为混合固定液( 含4
14、0 6 多聚甲醛和2 5 戊二醛) 3 0 0 m l 。灌注完毕后取脑，放入4 戊二醛中后固定。按下述 步骤切取相应脑块。 正中隆起取材过程如下：从4 戊二醛中取出脑块，用P B S ( = 蒸水配 置) 冲洗3 遍，去除软膜。在视交叉及垂体柄水平方向用刀片垂直切入 2 m m ，两者之间即为正中隆起。再沿正中隆起两侧l m m 矢状方向斜向内 侧切入2 m m ，即可将正中隆起取下。放入盛有P B S 的小玻璃瓶中轻轻摇 晃，冲洗3 次去除残留在正中隆起中的戊二醛。将样品块放入盛有P B S 小瓶中送电镜室制备电镜标本。 2 7 2 透射电镜标本的制备 ( 1 ) 将标本浸入4 戊二醛固定液中固定4 8 小时。 ( 2 ) P B S 浸洗三次，每次15 分钟。 ( 3 ) 2 单宁酸溶液浸泡1 5 小时。 ( 4 ) P B S 浸洗三次，每次l5 分钟。 ( 5 ) 1 四氧化锇后固定2 小时。 ( 6 ) P B S 浸洗三次，每次15 分钟。 ( 7
