杨梅花色苷对胰岛细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制探讨

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1、浙江大学医学院 博士学位论文 杨梅花色苷对胰岛细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制探讨 姓名：张波 申请学位级别：博士 专业：外科学 指导教师：吴育连 20100406 浙江人学博士学位论文中文摘要 杨梅花色苷对胰岛细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制探讨 浙江大学医学院：普通外科学 博士研究生：张波 导师：吴育连教授，主任医师 中文摘要 糖尿病是多基因遗传与环境因素长期共同作用所导致的一组以慢性高血糖为 特征的代谢性疾病，由于体内胰岛素相对或绝对分泌不足或靶细胞对胰岛素敏感 性降低所引起的内分泌代谢性疾病。胰岛移植是治疗1 型及部分2 型糖尿病极有 前景的治疗手段，能够生理条件下动态调控血糖水平

2、，脱离胰岛素依赖，延缓糖 尿病相关并发症的发生。然而在移植过程中，胰岛在分离、纯化及移植操作中数 量的损失及功能、活性的下降，移植后受炎症、排斥反应的打击损伤，使得需要 更多的胰岛来达到受体脱离胰岛素的目标，而供体的短缺，使得胰岛移植在临床 的广泛开展应用极大受限。因而，在供体缺乏的情况下，在移植前减少应激反应 对胰岛细胞的损伤，最大程度的保护胰岛细胞的活性和功能对胰岛移植的成功具 有重要意义。 胰岛在分离过程中胶原酶对其的毒性，分离纯化过程中的机械性损伤，离体 后缺血、缺氧等应激均可导致胰岛细胞内过量活性氧自由簇( R O S ) 的产生，而 胰岛本身其胞内抗氧化酶表达程度低，R O S 介

3、导的氧化应激在这些不利因素导致 细胞损伤过程中扮演重要角色。过量及长时的R O S 将会破坏细胞，自由基将破坏 细胞蛋白，膜脂以及核酸，最终导致细胞凋亡及坏死。研究发现在胰岛分离培养 过程中加入一些抗氧化剂可以减轻细胞损伤。如在胰岛分离过程中加入烟酰胺能 够提高胰岛得率及保护胰岛细胞降低H 2 0 2 诱导的细胞死亡。在培养基中加入谷 T 浙江大学博士学位论文 中文摘要 胱甘肽可以减少胰岛分离后M C P 1 和T F 的分泌。近年，越来越多的研究者将目 光转向天然的、特别是来源于植物的抗氧化剂，一些黄酮类物质( 如姜黄素) 能 够减少细胞因子刺激引起的胰岛细胞的凋亡；移植前预处理还可延长移植

4、物的生 存；某些植物组分还具有降低糖尿病鼠血糖，减少胰岛的损失及促进残余细胞胰 岛素分泌的作用。 花色苷是一种广泛分布于自然界的水溶性天然食用色素，属于黄酮多酚类化 合物，构成了花、果实、蔬菜中许多品种的蓝色、紫色、红色和黄色等，其在浆 果类( e d i b l eb e r r y ) 及其他有色植物中含量丰富。研究表明花色苷具有一系列的生 理活性，如抗氧化，保持基因组D N A 的完整性、抗炎症、抗肿瘤、降血脂等。富 含花色苷的浆果类提取物能够增加红细胞对体外氧化应激的抵抗力，长期食用花 色苷能够延缓糖尿病相关并发症的发生。B o l l e c 等发现山茱萸花色苷可增加胰岛素 释放功能

5、。 杨梅是我国特有的亚热带水果，因含有花色苷、杨梅素、二氢杨梅素等大量 生物活性物质而具有较高的营养和保健价值。既往研究表明，杨梅果实黄酮类化 合物中，花色苷占较高比例。提取花色苷对其进行H P L C 分析后发现，矢车菊素一3 葡萄糖苷( C 3 G ) 是最主要组分，占9 0 以上。杨梅果实提取物具有较强的氧自 由基清除活性，抗氧化能力与C 3 G 含量呈正相关。研究发现在高脂喂养的C 5 7 B L 6 小鼠食用C 3 G 能够明显降低血脂、血糖水平。杨梅花色苷具有良好的保健、医药 开发前景。目前关于杨梅花色苷在生物医学方面的研究甚少，而对于其在胰岛功 能保护领域的研究国内外均未见报道。

6、 本研究属国家自然科学基金资助项目( 编号：3 0 8 7 2 5 3 1 ) ，旨在探讨杨梅果实 提取物( 杨梅花色苷) 对胰岛细胞氧化应激损伤的保护效应及其分子机制，探索 其在胰岛移植领域的可能应用前景，为杨梅花色苷成为一种潜在的胰岛保护剂奠 定相应理论基础。我们同时还初步探讨了自噬在胰岛体外氧化应激损伤及体内移 植后的发生。 浙江人学博十学位论文 研究方法 1 、杨梅花色苷对胰岛细胞的保护效应 ( 1 ) 杨梅果实提取物( 花色苷) 的制备、鉴定及抗氧化活性的测定 杨梅( 荸荠种) 果实用含盐酸的甲醇溶液浸提，用旋转蒸发仪进行浓缩。提 取物中总酚类化合物的含量采用F o l i n C

7、i o c a l t e a u 比色法测定，总黄酮类化合物的 含量采用比色法测定，花色苷含量采用p H 示差分光光度法测定。 采用H P L C 对杨梅花色苷组成进行鉴定及含量测定；采用D P P H 方法测定杨 梅花色苷自由基清除活性。M T r 法观察其对胰岛细胞系I N S 1 的细胞毒性。 ( 2 ) 杨梅花色苷对H 2 0 2 诱导的胰岛细胞凋亡的影响 采用M T T 法观察花色苷预处理对胰岛细胞系的保护效应，用台盼蓝据染实验 及L D H 释放试验进一步验证。 采用R O S 特异荧光探针D C F D A 检测胞内R O S 的产生。H o e c h s t 3 3 2 5

8、 8 染色 观察细胞凋亡情况，流式细胞术观察细胞凋亡及死亡变化；提取细胞蛋白，w e s t e m b l o t 观察相关凋亡蛋白( c l e a v e d ) c a s p a s e 3 ，9 及B c l 2 的表达。 ( 3 ) 杨梅花色苷对H 2 0 2 诱导的胰岛细胞自噬的影响 将m I 玎P G F P L C 3 质粒转染I N S 1 细胞后，给予H 2 0 2 刺激，荧光显微镜下观 察细胞内L C 3 的点聚情况。电镜观察H 2 0 2 刺激后细胞内自噬泡的形成。W e s t e r n b l o t 观察H 2 0 2 刺激不同时间后，L C 3 和B E

9、C N I 的表达变化。 采用B E C N ls i R N A 下调B E C N l 表达，w e s t e r nb l o t 观察自噬相关蛋白L C 3 和 凋亡相关蛋白( c l e a v e d ) c a s p a s e 9 的变化，并进一步用M T T 法及L D H 释放试验 验证。 吖啶橙( A O ) 和单丹磺酰戊二胺( M D C ) 染色观察花色苷预处理是否可减少 H 2 0 2 诱导的自噬的发生。W e s t e r nb l o t 观察L C 3 和B E C N l 蛋白的表达。 ( 4 ) 杨梅花色苷预处理在肾包膜下移植后早期对细胞移植物的影响

10、 V 浙江人学博_ j ：学位论文中文摘要 将I N S 1 细胞移植入糖尿病受体小鼠肾包膜下，7 2 h 后取出移植物，部分用 4 多聚甲醛固定，部分用戊二醛固定以备做电镜，部分O C T 包埋剂包埋后液氮速 冻，8 0 。C 保存以备冰冻切片。石蜡切片行H & E 、i n s u l i n 和B E C N 1 免疫组化染色 及T U N E L 染色。冰冻切片行L C 3 免疫荧光染色，电镜观察移植物超微结构变化。 将I N S 1 细胞在移植前给予花色苷预处理2 4 后肾包膜下移植，7 2 h 后取出移 植侧肾脏，切片，行c l e a v e dc a s p a s e 3 、

11、L C 3 免疫荧光染色及B E C N 1 免疫组化染 色。 2 花色苷对胰岛细胞系保护机制的探讨 采用R T - P C R 及定量P C R 检测花色苷处理后I N S 1 细胞H O 1m R N A 的表达。 w e s t e r n b l o t 方法检测H O 1 的蛋白表达水平。 分离小鼠原代胰岛，给予花色苷处理，R T - P C R 和定量P C R 观察H O 1 的表达。 将处理后的胰岛冰冻切片并进行I n s u l i n 和H O 1 免疫荧光双染验证H O 1 的表达。 用H O 1s i R N A 下调H O 1 的表达后，给予l u M 花色苷2 4

12、h ，w e s t e r nb l o t 检测 H O 1 表达变化。M T T 法检测H O 1 下调后花色苷对胰岛细胞的保护效应。W e s t e m b l o t 检测c a s p a s e 3 ，9 及L C 3 的表达。 构建H O 1 高表达的I N S 1 细胞。给予空载体及p L N C X 2 H 0 1 转染后的细胞 H 2 0 2 刺激，M T T 法检测两组细胞活性。免疫荧光观察两组细胞H 2 0 2 刺激后L C 3 的点聚情况。 给予I N S 1 细胞花色苷处理后，w e s t e r nb l o t 观察p A k t 及A k t ，p E

13、R K l 2 及 E R K l 2 ，p J N K 及J N K l 2 蛋白的表达。用P D 9 8 0 5 9 或L Y 2 9 4 0 0 2 分别预先处理I N S 1 细胞，再给予花色苷孵育，w e s t e r nb l o t 检测H O 1 蛋白表达情况。细胞经P D 9 8 0 5 9 或L Y 2 9 4 0 0 2 预处理1 h ，花色苷孵育2 4 h 后，再给予H 2 0 2 ，M T T 法检测细胞活 性改变。 给予I N S 1 细胞花色苷处理后，激光共聚焦显微镜方法检测N r f 2 核转位情况， 提取细胞核蛋白，w e s t e r nb l o t

14、检测细胞核内N r f 2 的表达。 V I 浙江大学博1 ：学位论文中文摘要 研究结果 1 杨梅花色苷对胰岛细胞的保护效应 ( 1 ) 杨梅花色苷中最主要的成分为矢车菊素3 葡萄糖苷 杨梅果实提取物中花色苷为总黄酮类化合物中主要组成部分。对杨梅花色苷进 行H P L C 分析，发现矢车菊素3 葡萄糖苷为杨梅花色苷最主要成分，比例在9 0 以上。D P P H 法检测结果提示杨梅果实提取物具有较强的氧自由基清除活性。杨梅 花色苷浓度在5 u M 以内时，对I N S 1 细胞的活性无明显影响。 ( 2 ) 杨梅花色苷减少了H 2 0 2 诱导的胰岛细胞的凋亡和坏死 H 2 0 2 刺激导致细胞

15、活性下降，并呈浓度和时间依赖性，M T T 结果花色苷预处 理能够显著提高细胞活性，降低H 2 0 2 对其的损伤。台盼蓝据染实验和L D H 释放 实验进一步证明l u M 花色苷预处理2 4 h 可明显保护胰岛细胞系抵抗H 2 0 2 损伤。 P I 单染流式检测显示花色苷预处理明显减少了H 2 0 2 诱导的细胞坏死。 荧光显微镜及流式细胞仪检测提示花色苷预处理减少了H 2 0 2 诱导的胞内过 量R O S 的产生。流式细胞仪检测结果提示花色苷预处理减少了H 2 0 2 诱导的细胞 凋亡及坏死。W e s t e r nb l o t 显示花色苷预处理减少了H 2 0 2 诱导的c a

16、 s p a s e 3 ，9 的 剪切体的产生，并上调了B c l 2 的表达，进一步支持花色苷可减少H 2 0 2 诱导的凋 亡 ( 3 ) 杨梅花色苷减少了H 2 0 2 诱导的胰岛细胞的自噬 m I u P G F P L C 3 质粒转染I N S 1 细胞，给予H 2 0 2 刺激后，荧光显微镜观察 到胞浆内出现L C 3 的点聚。电镜观察发现在H 2 0 2 处理组细胞胞浆内出现较多明 显的空泡，有肿胀的线粒体及含胞内容物的自噬泡。W e s t e r nb l o t 结果提示l m M H 2 0 2 作用0 5 ，1 ，2 及4 h 后，L C 3 B 及B E C N l 的表达逐渐上调，且在2 h 处表达 量最高。 采用B E C N 1s i R N A 转染I N S 1 细胞下调B E C N 1 的表达，降低了H 2 0 2 诱导 V I I 浙江大学博士学位论文 中文摘要 的自噬的发生。W e s t e r nb l