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1、泰山医学院 硕士学位论文 槲皮素对血管平滑肌细胞电压依赖型钙通道的影响 姓名：周晓 申请学位级别：硕士 专业：病理学与病理生理学 指导教师：王家富;商战平 20090501 槲皮素对血管平滑肌细胞电压依赖型钙通道的影响 研究生：周晓 专业：病理学与病理生理学 导师：王家富教授 商战平教授 中文摘要 目的 观察槲皮素( Q u e r c e t i n ，Q u e ) 对人脐动脉平滑肌细胞( h u m a nu m b i l i c a l a r t e r ys m o o t hm u s c l ec e l l ，H U A S M C ) L 型和T 型电压依赖型钙通道( v
2、 o l t a g e - d e p e n d e n tc a l c i u me h a n n e l ，V D C C ) 的影响，为槲皮素抗动脉粥样硬化的作 用提供理论依据。 方法 1 人脐动脉组织贴块法培养H U A S M C ，a S m o o t hM u s c l eA c t i n 免疫细胞 化学染色鉴定，于2 3 代用于试验： 2 分组：培养的H U A S M C 胰酶消化脱壁后，充分混合，随机分为3 组。 对照组：不加入任何药物； 模型组：加入1 0 0 n m o l L 的内皮素一1 ( e n d o t h e l i n - - 1 ；E T
3、 一1 ) f 12 】； 实验组：加入1 0 0 n m o l L 的E T 一1 和2 0 0 m m o l L 的槲皮素【3 】： 3 加药后6 、1 2 、2 4 小时以逆转录聚合酶链反应( R e v e r s t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s e ，I U P C R ) 分别检测L 型钙通道和T 型钙通道蛋白的主要亚基 Q 1 C 和Q 1 G 的m R N A 表达。 4 加药后2 2 小时抗a l C 免疫染色各组细胞，检测荧光强度。 5 加药后2 2 小时抗0 【1G 检测各组蛋白的免疫印迹( w e s t
4、e r nb l o t ) 。 6 加药后2 2 小时全细胞膜片钳技术检测各组L 型钙通道电流和T 型钙 通道电流。 结果 1 R T - P C R 检测细胞0 【1C 和仅lGm R N A 的表达：各组0 【1G 的m R N A 表 达水平在加药后1 2 小时差异最显著，0 【l Gm R N A 的表达水平最高，试验组 次之，空白对照组最低，各组之间的差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 2 、免疫荧光法检测a l C 蛋白表达t 荧光显微镜下观察，各实验组的绿 色荧光强度明显高于阴性对照组；各实验组的荧光强度无差异，单位面积的 O D 值差异无统计学意义( p O 0 5
5、) 。 。 3 、免疫印迹法检测o t l G 蛋白表达：模型组a 1 G 蛋白的表达水平最高， 试验组次之，空白对照组最低。各组之间的差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ；干预因素与时间之间无交互效应( F = I 6 2 ， P O 0 5 ) 。 表1 槲皮素对a l Cm R N A 表达的影响( ；士s ，力= 5 ) T a b1E f f e c to f dq u e r c e t i no nt h ee x p r e s s i o no fa l Cm R N A ( x 4 - s ，n - 5 ) 注：8 p 0 0 5V Sc o n t r o lg r
6、o u p s ：。p 0 0 5V S E T 1g r o u p ；。p O 0 5V S6 h ；8 p 0 0 5V S1 2 h s - 兰2 5 窖 h 巨 z I 5 L ， R 一工叠 1 上 - - o C o a t r o l - 一z I o l - c l r r - I 憾 F i g u r e 7 E f f e c to f E T - 1a n dq u e r c e t i no nt h ee x p r e s s i o no falCm R N A 图7内皮素和槲皮素对a l Cm R N A 表达的影响 害 名1 备1 。1 1 C o n
7、t r o XE T - 1E T l + 瓴刀E F i g u r e8e x p r e s s i o no fa lCm R N Ao nt h et w e l v e t hh o u r 图8各组第12 小时0 【lCm R N A 的表达 2 5 以1 2 小时的敷据作方差分折显示三组之间相互比较的P 值均大于 O 0 5 ，没有统计学意义。提示E T - - l 和槲皮素对a l C m R N A 的表达没有显著 影响。 3 对a l Gm R N A 表达的影响从a l G 的R T - P C R 产物琼庸糖凝胶电泳 可以看出a l GmR N A 的表达随时问而变化
8、。各时间点t 条带的亮度不同， 以1 2 h 的表达展亮。同时，同一个时间点各组条带亮度有明显差异，以E T - I 组的表选最亮E T - I 加槲皮索组次之而空白组最弱。见图9 ： 5 0 0 b p 2 5 0 b p M a r k e r 12345678 9 F i g9A g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sf o rR T - P C Rp r o d u c to f a l Gg e n e 图9a l G 基因R T - P C R 产物的琼脂糖 n o t e ：l ；c o n t r o l6 h ，2 = E
9、T - 16 h 。3 = E T - 1 + O u e6 h ，4 = c o n t r o l1 2 h 。5 = E T1 2 h 6 _ E T - I + Q u e1 2 h ，7 = c o n t r o l2 4 h ，8 = E T - l2 4 h ，9 = E T - 1 + Q u e2 4 h 对各组数据进行两因素方差分析，E T ，E T - I + Q u e 组与对照组三组之间 吸光度比值差异有统计学意义( F 50 2 ，P 0 0 5V S12h 1 2 t2 一h t i 眦 _ - 一C o 丑t r O l _ I - l 巾n 。1 4 Q O
10、 J F i g u r e l0E f f e c to f E T - 1a n d Q u e r c e t i no nt h ee x p r e s s i o no f c tlGm R N A 图1 0内皮素1 和槲皮素对a l Gm R N A 表达的影响 3 Z5 2 1 5 l n5 0 C o r t t r o l E T 一1E T - 1 棚 F i g u r e 11 e x p r e s s i o no f alGm R N Ao nt h et w e l v e t hh o u r 图11各组第12 小时伍1Gm R N A 的表达 三、细胞免疫
11、荧光的结果 2 7 ，-r叫一静k脚 如前文所述。因为a l Gm R N A 的表达在1 2 小时达到峰值，所以对蛋白 及其功能的检测均以第2 2 h 作为检测时间点。 以抗a l C 免疫染色细胞后，荧光显徽镜下观察F I T C 受激发后产生的绿 色荧光，阴性对照组细胞表面绿色荧光很弱试验三组的绿色荧光明显增强， 但三组之间的亮度无明硅差别。结果见图1 2 。 CD F i g u r e l 2E f f e c to f E T - Ia n dq u e r c e t i no nt h ee x p r e s s i o no f a l Cp r o t e i n ( i
12、 m m u n o f l u o r e s c e n c e ，x 2 0 0 ) 图1 2 和槲皮素对a l C 蛋白表达的影响( 免疫荧光染色，x 2 0 0 ) A ：n e g a t i v ec o n t r o lg r o u p B ：c o n t r o lg r o u pC ：E T - Ig r o u p D ：E T - I + Q u eg r o u p 数据的采集和处理：椅测各组细胞区域的积分光密度，踪以对应的面积， 得到单位面积的积分光密度。见表3 和圈1 3 。结果显示，各组之问a l C 蛋 白表达差异没有统计学意义( P 值均大于0 0
13、5 ) 。提示内皮索一1 和槲皮素对 l c 蛋白表达的影响不显著。 表3 内皮素和姑皮囊对a l C 蛋白表达的影响t ；s ，_ = 5 ) T a b3E f f e c to fE T - Ia n dq u e r e e t i no Et k ee x p r e s s J o f lo f a l CP r o t e i n ( ；s ， = 5 ) G _ r o u pO Dv a B u e C o n t r o l 注：英文字母相同者，p 00 5 ：荚空字母不同者p O0 5 ；D i f f e 陀n ! E n g l i s ha l p h a b e
14、tp O 0 5 ；英文字母不同者，p O 0 5 ；D i f f e r e n tE n g l i s ha l p h a b e tp O 0 5 ；英文字母不同者，p O 0 5 ；D i f f e r e n tE n g l i s ha l p h a b e tp 0 0 5 F i g u r e l8E f f e c to f E T - 1a n dq u e r c e t i no nt h eC a 2 + c u r r e n to f L - t y p ec h a n n e l 图1 8E T - 1 和槲皮素对L 型钙通道电流的影响 2 Q
15、u e 对T 型钙通道的影响 以硝苯地平( 1 1 t m o l L ) 阻断L 型钙通道， 钳制电位9 0 m V ，给予一个4 0 m V 时程4 0 0 m s 的单刺激，各组T 型钙通道的 电流见图l 9 。 3 2 6 5 4 3 2 l 0 h二n暑甚。基口。 E T 一1 + Q u e I O O p A c o n t r o l F i g u r e19 E f f e c to f E T - 1a n dq u e r c e t i no nt h eC a 2 + c u r r e n to fT - t y p ec h a n n e l 图1 9E T
16、- 1 和槲皮素对T 型钙通道电流的影响 取各组的最大电流密度值作统计分析，结果显示，三组之间的相互差异 都有显著的统计学意义( P 均 O 0 5 ：英文字母不同者，p O 0 5 ；D i f f e r e n tE n g l i s ha l p h a b e tp 0 0 5 ) ，而Q 1Gm R N A 的表达量之间有差别( p 0 0 5 ) ，提示内皮素一1 和槲皮素对 V S M C 膜上a 1 C 的表达没有明显的影响。W e s t e r nb l o t 检测各组仅1 G ，结果显 示内皮素一1 增加0 【1G 的表达( P 0 0 5 ) ，槲皮素则拮抗内皮素一l 增加0 【1G 表达的作用( p 0 0 5 ) ，但相对于空白对照都 有统计学意义( p 0 0 5 ) 。T 型钙通道电流密度最大值三个组之间有显著差 异，模型组是空白对照组的3 1 6 倍，试验组是空白对照组
