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1、核酸检测实验室建立与应用卫生部临检中心深圳市血液中心血液病毒核酸检测联合实验室叶贤林1核酸扩增检测实验室的建立n人员n场地n检测方法选择n实施方案依据：卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号）Date2核酸实验室人员要求n资质:经过临检中心PCR培训班培训并取得上岗证；通过血站核酸实验室岗前培训考试合格。n培训:无”核酸”的概念形成防污染的概念良好工作习惯的培养.报告的正确发放.n后备人员的培养.Date3试剂准备区标本制备区扩增区及扩增产物分析区样本离心交接区报告发放区核酸实验场地Date4方法选择:TMA与PCRTMAPCR扩增原理模拟自然DNA转录成mRNA
2、的过程模拟自然DNA复制的过程靶目标RNADNA酶MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反应体系两种酶，两条引物，dNTPNTP一种酶，一对引物，dNTP温度条件恒温（41.5）循环导热（变性，退火，延伸）扩增仪器水浴箱或者加热块热循环仪扩增产物RNADNA扩增速度每个循环可以生成100-1000个复制物，在15-30分钟内可增加10亿倍复制物以2n扩增，23h就能将待扩目的基因扩增放大10亿倍Date5TMA的优点缺点自动动化程度高灵敏度高扩扩增效率高：10n不能绝对绝对定量Date6PCR的优点缺点易于自动动化灵敏度高扩扩增效率高汇汇集拆分过过程繁琐琐拆分可减低非反应应性比率Dat
3、e7核酸试剂质控n试剂的确认试剂运输过程的控制(温度条件时限)灵敏度的要求内标的要求n试剂涵盖的基因型Date8检测流程(1):常规筛查合格汇集标本检测流程Date9检测流程(2):常规筛查合格单人份标本检测流程Date10检测流程(3):平行检测流程样本清点交接核酸单份检测常规检测合格标本不合格标本阴性标本反应性标本合格标本发布结果单项目反应性无反应性阳性或可疑结果淘汰阳性或可疑结果淘汰Date11标准操作规程(SOP)的编写n核酸实验室设置与管理规范n核酸实验室标本检测流程n核酸实验室岗位职责n核酸实验室关键试剂管理规范n核酸实验室仪器设备管理规范n核酸实验室检测标本管理规范n核酸实验室室
4、间质量评价规范n核酸实验室记录管理制度n核酸实验室生物防护规范n核酸反应性献血者追踪规程n核酸实验室检测应急措施Date12标准操作规程(SOP)的编写n核酸标本离心交接操作规程n核酸标本提取及汇集操作规程(科华)n核酸标本扩增检测操作规程（科华）n核酸标本全自动检测分析系统操作规程（CHIRON）n核酸标本检测报告发布操作规程（唐山软件）n核酸标本检测复检操作规程n生物安全柜标准操作规程n可移动紫外线灯标准操作规程n低温高速离心机标准操作规程nABI7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程Date13核酸实验室防污染措施n主要的污染源n扩增产物n标本之间产生的气溶胶n操作人员n手n衣服Dat
5、e14核酸实验室防污染措施n要有独立的空气处理系统.n各区始终处于完全分隔的状态，不能有空气的直接相通n实验室保持合理的通风n对各区内的设备、物料进行标示，专区专用；其他物品不得混用（例如：笔、纸张）n空气：试剂准备区标本制备区扩增区产物分析区n试剂阳性对照储存在标本制备区n使用带滤芯的吸头Date15核酸实验室防污染措施n使用外排式的生物安全柜n自配试剂应分装成小规格，未用完的试剂应废弃n使用次氯酸钠溶液消毒（台面、地面）n使用1molL的HCL溶液（吸头）n使用紫外线照射（空气和台面）n使用无水乙醇溶液（空气喷雾）Date16核酸实验室污染后措施n实验室污染后，如何处理？n通风n次氯酸钠溶
6、液（扩增区不宜使用）nHCL溶液（吸头）n紫外线（固定、移动）n酒精喷洒（空气）n应设计有备用实验室:如开设独立的报告发放区作为备用Date17中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取、反转录及扩增过程的效率。血筛核酸检测的内标的作用内标的作用质控整个反应。提示假阴性检测结果。监控反应的外部条件内标浓度要合适保持适度的内标失控.(ChiSqIntercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011应用SAS9.0软件PROBIT分析结果Date21ProbitA
7、nalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4
8、011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.49822Date22Date23阳性献血者的追踪n沟通原则:专业授权、人性化、保密、尊敬。n沟通方式：电话、面谈n沟通技巧：表扬和鼓励、合理解释、知情、适当的问候Date24献血者核酸检测不合格解释n由于核酸检测方法目前尚不能排除假阳性，对实验过程要求极高，另外乙肝和丙肝病毒进入人体后，人体又有清除现象，但血液不能用于临床，因此核酸
9、检测不合格血液仅表示该血液不能用于临床输血。n不作为献血者健康体检指标。n更不宜作为疾病诊疗指标。n献血者献血权利仍保留。Date25关于核酸检测的解释n汇集结果成反应性拆分结果为阴性.n内标失败.nELISA(+)核酸结果为(-)nELISA(-)核酸结果为(+)n核酸单检结果反应性与血液发放.n化学发光法与核酸检测.Date261.灵敏度：汇集池大小要满足灵敏度要求。灵敏度太低，病毒低载量献血者漏检。HBVDNA灵敏度宜50拷贝ml.2.引物是否有效性能否检测亚型和突变株感染。3.假阳性，防污染措施（血筛主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率与自动化.5.需要规范化场地和高素质的操作
10、人员.6.参加国际间室间质控提高检测水准.血液核酸筛查注意的问题Date27深圳血液中心核酸检测概况n对161228人份酶免疫检测结果阴性标本进行核酸检测，共检出33例不相同HBVDNA阳性献血者，总比率为1：4885。n检出anti-HCV阴性、HCVRNA阳性1例，定量结果为1.2105IUml。3个月后追踪结果发现anti-HCV（+），ALT由正常升高至700UL。Date28项目科华（自动化）科华（半自动化）美国罗氏上海浩源凯荣（CHIRON）方法学全自动动提取+实实时荧时荧光PCR病毒离心富集+半自动动提取+实时实时荧荧光PCR全自动动提取+PCR-ELISA半自动动提取+PCR+
11、毛细细管电电泳分离TMA汇汇集量845ul8150ul2445ul5200ul500ul单单人份检测检测数6849637041315121412514603HBVDNA阳性数122838HBV阳性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸检测概况Date29HBVDNA阳性献血者追踪情况n对17位HBVDNA阳性献血者进行了追踪，9位献血者发生血清转换现象。n4例呈窗口期特征（或部分），n2例献血者发现病毒感染后自愈现象n1例献血者原为乙肝大三阳患者，经治疗后HBsAg转阴后，献血，常规检测为合格，核酸检测HBVDNA（+），经追踪后HBsAg变为阳性D
12、ate30Date31Date32Date33Date34Date35HBVDNA检测阳性献血者追踪概况追踪时间(d)ALT（IUL）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cpml）1(031023)18+21241504528未检出9126未检出15631未检出21429未检出Date361号献血者在追踪时表明曾经是大三阳治疗转阴后献血被核酸检出阳性7天后HBsAg检测(+).Date37Date381.PoolingbySTARprocessor2.Virusenrichmentbycentrfugation3.ExtractedbyKHB-10004.AmplifiedanddetectedbyABI7300Date39Date401.poolingandextractionbySTARLET2.AmplificationanddetectionbyABI7300AutomationprocessDate41Date42Date43Date44MANYTHANKS!nE-mail:YEXIANLIN90HOTMAIL.COM问题Date45谢谢大家！Date46
