动物细胞培养技

《动物细胞培养技》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物细胞培养技（100页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、动物细胞培养技术 1.动物细胞的生长与培养 动物细胞的特点 l进化程度高 l结构、形态、成分复杂 l细胞间连接形式多样 l生长相对缓慢 l功能全面 1.1 培养细胞的生物学特征 Hepatocytes 体外培养细胞的分型 （一）贴附型 成纤维细胞型 上皮型细胞 游走细胞型 多形型细胞 （二）悬浮型 （三）半贴壁型 （一）贴附型： 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞 贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本 存在方式 结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组 织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生 存和生长。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需

2、要贴附于 某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞 贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才 能生存的细胞 细胞在体内、外的贴附方式：存在差异 体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外 形一般与体内时明显不同 贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 1、成纤维细胞型： 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起， 中

3、有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起 2、上皮型细胞： 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动 3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。 4、多型细胞型

4、： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。 （二）悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞 。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容 易大量繁殖。 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离 无菌无毒害的环境1 支持生长增殖的营养2 其它类似体内的环境3 维持细胞性状4 1.2 细胞培养总原

5、则 (一) 细胞培养无菌无毒环境 l 实验室设计合理 l 常用设施及设备 l 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。 细胞培养无菌操作基本技术 l工作环境及表面的处理 l细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 l培养液与培养细胞的处理 (二) 细胞的营养 l 培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 l 血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一 ，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营 养成分 。 l 其它成分（条件

6、培养基） 合成培养基的主要成分 l氨基酸 l碳水化合物 l无机盐 l维生素 l其它辅助物质 培养基种类 l RPMI-1640（标准型 ） l DMEM-高糖（标准型 ） l DMEM-低糖（标准型 ） l McCoys 5A l M199 l F12 血清 牛血清、马血清、人血清 （1）储存于-20 - 70 低温冰箱中 （2）一般厂商提供的血清为无菌 （3）热灭活是指56, 30 分钟加热已完全 解冻的血清，目的是使血清中的补体成分 （complement）灭活 （4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心 3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。 其它常用液体试剂 lHanks lD-Ha

7、nks lPBS lNaHCO3（ 7.5% ） l胰酶溶液（0.25%） (三) 其它类似体内的环境 n温度 n气体 n渗透压 n氢离子浓度(PH) n其他 (四)合理的计划，维持细胞性状 尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复 的细胞以及转染后稳定存在的细胞 需要做实验的细胞要选对数生长期 防止细胞污染，如遇污染，及时处理 一、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细 胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能 因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌 。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改 变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下 发现菌体才知污

8、染。所以，每天应仔细观察。污染后 细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆 脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。 二、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节 进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔 子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的 小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下 可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基 中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边 和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶 用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其

9、瓶底外面生长的菌丝相 混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒 性作用而使细胞脱落死亡。 三、支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微 生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除 它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发 现，能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存，对青霉素 有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子 密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生 长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细 胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理， 还会产生交叉污染。

10、四、病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在 病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原 代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒 。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗 是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病 毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、转 化，形成异倍体的细胞系。 五、非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没 有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一 种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞 的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的， 而现在却认为是HeLa细胞。 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也

11、偶有发 生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底 而带入一些有毒化学物质所致。 常用的排除微生物污染的方法 u 抗生素排除法：采用510倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用2448h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。 u 加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用510h（最长可达18h），以杀灭支 原体。 u 动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养 u 与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活710天，并保 持吞

12、噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污 染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。 1.3 培养细胞的生长和增殖过程 幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养 单个细胞 细胞 悬液10代 细胞 50代 细胞 无限传 代 原代培养 传代培养 如何界定原代培养和传代培养； 多数组织细胞固定在表面 生长和分裂。 随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变遗传物质未改变 l原代培养：从机体取出后立即培养的 细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与 传10代以内的细胞称为原代细胞培养 。 l传代培养：将原代细胞从培养瓶中取 出，配制成细胞悬浮液，分装到两个 或两个以上的

13、培养瓶中继续培养，称 为传代培养。 有关概念 细胞的原代培养 将动物机体的各种组织从机体中取出，经 各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细 胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以 生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养 。 组织块直接培养法（机械法） 1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。 2、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血 液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块（1-2mm），再用Hanks 液洗三次，转移至小青霉素瓶中 4、

14、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面 5、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触 组织块。入37静置35小时，轻轻翻转培养瓶， 使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培 养 胰酶消化法 1、取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。 2、用Hanks液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血 液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hanks 液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消 化2040分钟，每隔5分钟振荡一次.

15、5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑 制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。 6、静置，使未分散的组织块下沉。 7、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适 量培养液，37下培养。 （一）培养细胞生命期 在培养中持续增殖和生长的时间。 1原代培养期： 从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（ 初代培养） 特点：1一4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞 分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相 似性、多呈二倍体核型 细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细 胞独立生存性差。 2传代期： 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件 较好情况下，细胞

16、增殖旺盛，并能维持二倍体 核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。 为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期 或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050 次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止， 细胞进入第三期。 3衰退期： 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖； 细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三 期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可 能发生自发转化。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶 性性。 细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖 能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连 续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二 期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核 型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法 诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细 胞永生性和恶性性非同一性状。 （二）组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词，系指从 细胞接种到分离再培养时的一段时 间，这已成为培养工作中的一种习 惯说法，它与细胞倍增一代非同一 含义。如某一细胞系为第153