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1、动物细胞培养技术 1.动物细胞的生长与培养 动物细胞的特点 l进化程度高 l结构、形态、成分复杂 l细胞间连接形式多样 l生长相对缓慢 l功能全面 1.1 培养细胞的生物学特征 Hepatocytes 体外培养细胞的分型 (一)贴附型 成纤维细胞型 上皮型细胞 游走细胞型 多形型细胞 (二)悬浮型 (三)半贴壁型 (一)贴附型: 大多数培养细胞贴附生长,属于贴壁依赖性细胞 贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本 存在方式 结果: 基于贴附特性,使细胞与细胞之间相互结合形成组 织,有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生 存和生长。 培养时:这些细胞被放到体外环境中以后,同样需
2、要贴附于 某一固相表面才能生存和生长,因而属于贴附型细胞 贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞:唯有贴附于固相表面才 能生存的细胞 细胞在体内、外的贴附方式:存在差异 体内:贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征 体外:多数情况,细胞只有一个附着平面,外 形一般与体内时明显不同 贴附的固相表面:玻璃、聚苯乙烯塑料 按照培养细胞的主要形态,可分为几大类型 1、成纤维细胞型: 名称:凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源:由中胚层间充质组织起源的组织如: 真正的成纤维细胞:心肌,平滑肌,成骨细胞, 血管内皮 形态:似体内成纤维细胞的形态,胞体梭形或不规则 三角形,胞质向外伸出23个长短不等的突起, 中
3、有卵圆形核 生长特点:排列成放射状,漩涡状,并不紧靠连成片, 细胞细胞接触易断开而单独行动,游离的单独 的成纤维样细胞,常有几个伸长的细胞突起 2、上皮型细胞: 名称:仅形态上似体内,实际上不完全相同 来源:来源于外胚层、内胚层细胞, 如:皮肤及其衍 生物,消化道,乳腺,肺泡, 上皮性肿瘤 形态:类似体内的上皮细胞,扁平,不规则多角形, 中有圆形核 生长特点:易相连成片,相靠紧密相连成薄层 铺石状生长时呈膜状移动,很少脱离细胞群而单个 活动 3、游走细胞型: 呈散在生长,一般不连成片,胞质常 突起,呈活跃游走或变形运动,方向不规 则。此型细胞不稳定,有时难以和其他细 胞相区别。 4、多型细胞型
4、: 有一些细胞,如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态,可统归于此类。 (二)悬浮型: 见于少数特殊的细胞,如某些类型的癌细胞及白血病细胞 。胞体圆形,不贴于支持物上,呈悬浮生长。这类细胞容 易大量繁殖。 概念:培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源:自血,脾或骨髓,血中白细胞癌肿细胞 特点:在悬浮中生长良好细胞圆形,单个或小细胞团 优点:生存空间大,提供数量大,传代方便(不需消化), 易于收获,可获得稳定状态 缺点:纯化不方便,不能通过离心将死、活细胞分离 无菌无毒害的环境1 支持生长增殖的营养2 其它类似体内的环境3 维持细胞性状4 1.2 细胞培养总原
5、则 (一) 细胞培养无菌无毒环境 l 实验室设计合理 l 常用设施及设备 l 培养器皿: 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的 材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中 性硬度玻璃制品。 细胞培养无菌操作基本技术 l工作环境及表面的处理 l细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 l培养液与培养细胞的处理 (二) 细胞的营养 l 培养基:合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 l 血清:血清是细胞培养液中最重要的成分之一 ,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营 养成分 。 l 其它成分(条件
6、培养基) 合成培养基的主要成分 l氨基酸 l碳水化合物 l无机盐 l维生素 l其它辅助物质 培养基种类 l RPMI-1640(标准型 ) l DMEM-高糖(标准型 ) l DMEM-低糖(标准型 ) l McCoys 5A l M199 l F12 血清 牛血清、马血清、人血清 (1)储存于-20 - 70 低温冰箱中 (2)一般厂商提供的血清为无菌 (3)热灭活是指56, 30 分钟加热已完全 解冻的血清,目的是使血清中的补体成分 (complement)灭活 (4)血清中的沉淀物絮状物,可用离心 3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理。 其它常用液体试剂 lHanks lD-Ha
7、nks lPBS lNaHCO3( 7.5% ) l胰酶溶液(0.25%) (三) 其它类似体内的环境 n温度 n气体 n渗透压 n氢离子浓度(PH) n其他 (四)合理的计划,维持细胞性状 尽早冻存原代细胞,复苏后状态恢复 的细胞以及转染后稳定存在的细胞 需要做实验的细胞要选对数生长期 防止细胞污染,如遇污染,及时处理 一、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细 胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能 因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌 。 培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改 变。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下 发现菌体才知污
8、染。所以,每天应仔细观察。污染后 细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆 脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。 二、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤其在霉雨季节 进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔 子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的 小点,有的散在生长,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下 可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基 中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边 和细胞之间。个体细小,有增多趋势。镜下看时,要将培养瓶 用酒精棉球擦干净,以防止与瓶外尤其
9、瓶底外面生长的菌丝相 混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,但最后由于营养耗尽及毒 性作用而使细胞脱落死亡。 三、支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微 生物,最小直径0.2m,一般过滤除菌无法去除 它,光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发 现,能在偏碱条件(pH7.68.0)下生存,对青霉素 有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 电镜下可见其有三层结构,无细胞壁,中央有电子 密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。 培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生 长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细 胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理, 还会产生交叉污染。
10、四、病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗,如果没有除去潜在 病毒的组织培养物,会产生病毒污染。目前,从原 代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒 。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养,但生产疫苗 是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病 毒,B淋巴细胞含EB病毒,细胞会发生变异、转 化,形成异倍体的细胞系。 五、非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没 有严格分开,操作不当,往往会使一种细胞被另一 种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞 的混合物,ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的, 而现在却认为是HeLa细胞。 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也
11、偶有发 生,大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底 而带入一些有毒化学物质所致。 常用的排除微生物污染的方法 u 抗生素排除法:采用510倍于常用量的冲击法,加入高浓 度抗生素后作用2448h,再换入常规培养物,有时可能奏 效。 u 加温除菌:根据支原体不耐热的特点,可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用510h(最长可达18h),以杀灭支 原体。 u 动物体内接种:受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内,利用动物的免疫功能消灭污染的微生物,而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长,待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养 u 与巨噬细胞共培养:巨噬细胞在体外可存活710天,并保 持吞
12、噬、消化微生物的能力。利用这一特点,可将少量的污 染细胞与足够量的巨噬细胞共培养,从而消除污染。 1.3 培养细胞的生长和增殖过程 幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养 单个细胞 细胞 悬液10代 细胞 50代 细胞 无限传 代 原代培养 传代培养 如何界定原代培养和传代培养; 多数组织细胞固定在表面 生长和分裂。 随细胞增多,细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变遗传物质未改变 l原代培养:从机体取出后立即培养的 细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与 传10代以内的细胞称为原代细胞培养 。 l传代培养:将原代细胞从培养瓶中取 出,配制成细胞悬浮液,分装到两个 或两个以上的
13、培养瓶中继续培养,称 为传代培养。 有关概念 细胞的原代培养 将动物机体的各种组织从机体中取出,经 各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用 EDTA)或机械方法处理,分散成单细 胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以 生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养 。 组织块直接培养法(机械法) 1、取材:将小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡23秒钟 (时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再 用碘酒消毒腹部,将鼠带入超净台内解剖取肝脏,置 平皿中。 2、用Hanks液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血 液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块(1-2mm),再用Hanks 液洗三次,转移至小青霉素瓶中 4、
14、将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面 5、翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触 组织块。入37静置35小时,轻轻翻转培养瓶, 使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37继续培 养 胰酶消化法 1、取材:将小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡23秒钟 (时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再 用碘酒消毒腹部,将鼠带入超净台内解剖取肝脏,置 平皿中。 2、用Hanks液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血 液等杂物。 3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hanks 液洗三次,转移至小青霉素瓶中。 4、视组织块量加入56倍的0.25%胰酶液,37中消 化2040分钟,每隔5分钟振荡一次.
15、5、加入2ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑 制剂),用吸管吹打,冲散细胞。 6、静置,使未分散的组织块下沉。 7、吸取上层细胞悬液,转移到两个培养皿中,补加适 量培养液,37下培养。 (一)培养细胞生命期 在培养中持续增殖和生长的时间。 1原代培养期: 从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段( 初代培养) 特点:1一4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞 分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相 似性、多呈二倍体核型 细胞群是异质的,细胞克隆形成率很低,即细 胞独立生存性差。 2传代期: 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件 较好情况下,细胞
16、增殖旺盛,并能维持二倍体 核型,呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。 为保持二倍体细胞性质,细胞应在初代培养期 或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050 次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止, 细胞进入第三期。 3衰退期: 此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖; 细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段,少数情况下,在以上三 期任何一点,由于某种因素的影响,细胞可 能发生自发转化。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶 性性。 细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增殖 能力,这样的细胞群体称无限细胞系,也称连 续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二 期末,或第三期初阶段。细胞获不死性后,核 型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法 诱发,转化后的细胞也可能具有恶性性质。细 胞永生性和恶性性非同一性状。 (二)组织培养细胞一代生存期 所谓细胞“一代”一词,系指从 细胞接种到分离再培养时的一段时 间,这已成为培养工作中的一种习 惯说法,它与细胞倍增一代非同一 含义。如某一细胞系为第153