现代生物技术_03动物基因工程剖析

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1、第三章第三章2 2 动物基因工程动物基因工程 概述 1、动物转基因技术的基本概念 2、外源基因导入动物体内的研究方法 3、动物转基因的载体 1）病毒载体 2）反转录病毒载体 4、转基因动物技术的应用 1）研究基因的表达与功能 2）利用转基因动物或细胞生产生物大分子 3）利用转基因动物细胞生产人体蛋白 4）利用转基因动物技术改良动物 5、克隆动物 概况概况 1、1982年，美国华盛顿大学RD.Palmiter等采用显 微注射法，将大鼠生长基因导入小鼠受精卵的雄原 核内，得到转基因小鼠以来，实现了动物种系内和 种系间细胞的基因转移，构建了各种转基因动物。 2、转基因动物技术具有广泛的应用：研究基因

2、的表达 与功能，生产生物大分子；生产人体蛋白；改良动 物；医用转动物模型。例如研究哺乳动物的基因表 达和发育、人类疾病的动物模型系统的建立，在动 物乳汁中生产重要的医用蛋白等等。 3、转基因人的研究只能限于体细胞的基因治疗，具有 遗传特征修饰的转基因人的研究，可否迈出历史的 一步？问题多多。 4、动物基因转移无论用何技术，转移效率极低。 第一节第一节 基本概念基本概念 1、定义： 基因转动物（transgenic animal)：指基因组 中整合有用转基因技术所导入的外源基因（ 或特定的DNA片段），整个技术则称为转基 因技术(transgenic technology或 transgenes

3、is)。 理论上讲任何动物都可以通过性系基因操 作成相应的转基因动物（如：鱼、鼠、羊、 牛等） 2 2、动物转基因技术程序、动物转基因技术程序 将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞 核中； 接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使 其顺利完成胚胎发育； 移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部 分后代其细胞中都携带有转入的外源基因； 利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或 种禽，培育新的纯合系。 3 3、动物转基因的效率、动物转基因的效率 动物基因转移的起点和终点分别为受精 卵和含有整合转基因的动物子代。在这个过 程中，转基因的效率极低。以小鼠转基因为 例： 以小鼠转基因为例： 注射外源基因后受

4、精卵的存活率为86； 将受精卵移殖到母鼠子宫内后受精卵的存 活 率为25 母鼠的怀孕率为80 转基因在基因组上的整合率为24 因此小鼠转基因的总有效率约为4 4 4、动物基因的结构、动物基因的结构 1）基因组片段：分子较大，保持较完整的基因结构 。 2）融合基因：将不同来源的结构基因、非编码序列 、 表达调控序列重组成杂合单元。 3）小基因：分别取同一基因的某一区域或若干区域 组成转基因。 4）靶基因：结构基因或调控序列经诱变或定向突变 处理后，重新输回动物体内。 5）插入基因：含有在动物染色体上随机或特异性插 入位点，可装标记基因。 6）置换基因：两侧含动物基因或其他DNA区域的同 源序列。

5、 5 5、动动动动物物转转转转基因的表达特性基因的表达特性 1.转基因的时空特异性表达 动物基因表达调控的显著特性：时空特异性， 特别是在发育过程中，相关基因的时序特异性和 组织特异性表达更为严格。 2.转基因的可控表达 诱导动物细胞内的转基因，对其稳定高效表达 至关重要，转基因的诱导条件取决于受体细胞的 性质和启动子的类型。 3.转基因的共抑制效应 在转基因动物体内，转基因的表达常会发生转 基因的失活，也称为转基因沉默。 共共抑制效应特征抑制效应特征 1）共抑制只发生在转基因与同源的内源性基 因之间，对其他的基因表达不产生影响； 2）如果转基因与内源基因发生体内重组，则 共抑制效应随之消失，

6、基因表达恢复正常； 3）共抑制现象的发生与结构基因的编码区有 关，但不依赖于启动子的来源和性质。 4）两个相同的转基因之间也能发生共抑制效 应。 造成转基因共抑制效应的原因造成转基因共抑制效应的原因 1）转基因与其同源的内源性基因相互作用，形 成某种状态而影响两者表达； 2）转基因与内源基因竞争性结合核基质和核包 膜上转录翻译必须的非扩散元件，导致相互抑 制； 3）两者转录出互为反义的RNA结构，使之失活 并 迅速降解； 4）由于转基因的存在，受体细胞中mRNA的大 量积累，并激活某些未知酶系的表达，导致 mRNA降解。 转基因表达单方面失活的原因转基因表达单方面失活的原因 转基因动物体内的转

7、基因表达单方面失活，而 同源的内源性基因却表达正常。 1）转基因被受体细胞识别为异己DNA，并将它 甲基化修饰，使其失活； 2）转基因整合在不合适的染色体部位，受局部 条件影响而不表达； 3）转基因本身的结构不利于其表达。 6 6、动物转基因的生物学特性效应、动物转基因的生物学特性效应 1 1）应用于动物基因组结构与功能的研究 以报告基因为转基因探测动物或人基因组中时空 特异性表达调控序列； 以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建 基因表达缺陷功能丧失的动物模型，以筛选 鉴定人类功能性基因，并为药物提供实验实体； 以同源基因为转基体内检测其表达特性及产物的 生物效应。 2 2）转基因技术改

8、良动物物种 3 3）对人体中数千种分子病的基因治疗 4 4）利用此技术构建优异的动物反应器 为什么要选为什么要选鼠作鼠作转基因动物模型转基因动物模型 ？ 1、人类与老鼠共享着80的遗传物质和99的 基因，人类和老鼠基因组同源度高，对它进行 比较研究可以得知很多关于人类疾病和生理机 能的研究，因此了解老鼠非常有助于了解人类 本身。 2、由于鼠的生殖周期短，产仔数多，基 因整合率较高。饲养成本较低，因此成为 转基因动物实验的首选动物。 为什么要选择乳腺来生产药物蛋白为什么要选择乳腺来生产药物蛋白? ? 1, 奶汁可以由乳腺不断地分泌，而且产量很高，长 期收集也不会对动物造成伤害； 2，将新的药物蛋

9、白限制在乳腺内生产，最后分泌到 乳汁中，一般不易对转基因动物的正常生理活动造 成影响； 3，乳腺分泌的蛋白质是经过正常的高等哺乳动物的 翻译后加工的，这使得生产的药物蛋白更接近于人 类自身的蛋白质； 4，乳汁中蛋白纯化起来相对较为容易，而且在乳汁 中含有的其他蛋白质也为数不多(表121)。 第二节第二节 动物转基因的研究方法动物转基因的研究方法 最早发展并较为完善的系统是小鼠进行转 基因实验 从20世纪80年代初期到现在，人们已经将上百 种不同的基因转人了小鼠，这些研究为进一步 了解高等动物的基因表达调控、肿瘤的发生、 免疫特异性、胚胎发生、发育过程以及分子遗 传学等基础生物学过程做出了重要贡

10、献； 同时，在判断利用家畜生产人类药物的可行性 、构建人类各种遗传疾病的生物医学模型方面 ，转基因鼠也发挥了重要的作用。 1 1、转基因技术的主要方法、转基因技术的主要方法 一、利用反转录病毒载体将外源基因转 入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物 中； 二、利用显微注射法将DNA直接注射入受 精卵的精前核中； 三、将基因工程改造过的胚胎干细胞导 入早期胚胎中。 用该方法已成功地得到了猪、羊、鸡、 免、牛、鱼等多种转基因动物。 2 2 、 反转录病毒法反转录病毒法 在各种基因转移方法中，通过反转 录 病毒载体把外源基因整合到受体细胞核 基 因组中是目前最有效的方法之一(图12 1)。 图12-1

11、通过反转录病毒载体获得转基因小鼠 反转录病毒法的缺陷反转录病毒法的缺陷 1）反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(10kb)。转入的基因易缺少其邻近的调控序 列。 2）反转录病毒载体因缺失了复制功能序列，在复 制载体DNA所用的辅助病毒(helper virus)基因组 也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中。另外 转基因动物自身也有可能产生辅助病毒株。这样转 基因动物虽合成了人们所需的产品，但也有可能大 量复制病毒。 3）目前的技术水平要完全杜绝反转录病毒在转基 因动物商品中的污染是很难做到的。因此一般人们 很少用反转录病毒载体来制造商业生产的转基因动 物。 3 3、 DNADNA

12、显微注射法（显微注射法（1 1） 用显微注射器把DNA直接注射到动物的 细胞质或细胞核中（直接注射和穿刺导入法 ）。 受体细胞： 1）多为沿培养皿壁生长的单层细胞； 2）动物的卵细胞。 转化效率：取决于注射DNA性质和注射技 巧。 3 3 、 DNADNA显微注射法（显微注射法（2 2） 向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48h后再注射人 的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵，经处理的雌鼠可 以产约35个卵细胞/次、正常雌鼠只能产510个卵细胞 /次。然后，从这些交配后的雌鼠的输卵管中取出受精 卵。随后将外源基因注射进受精卵中。 微注射的转入基因常要删除原核载体序列的线性DNA。 在哺乳动物中，精于进

13、入卵细胞后的l h内，精前核和 卵细胞的核都是分开的。等到卵细胞核完成减数分裂， 成为卵前核时，核融合才进行，这又称为核配。DNA微 注射要在精前核时注射才能有效。精前核比卵前核更大 ，因此可在显微镜下找到处在精前核状态下的受精卵。 并对受精卵进行取向和固定，然后进行DNA微注射(图12 2)。 图122 DNA显微注射示意图 3 3、DNADNA显微注射法显微注射法(3)(3) 注射完成后，用显微外科手术将25 40个受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内 ，制造雌鼠假孕（可以让它与切除了输 精管的不育雄鼠交配），将受精卵移入 代孕母鼠子宫中大约3周后，接受过注 射的受精卵发育生长为幼鼠，由代孕母 鼠

14、产下(图12-3)。 图12-3 3 3、DNADNA显微注射法显微注射法(4)(4) 转基因动物进行检测： 1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA进行 Southern杂交或PCR检测，看是否存在转入 基因。 2）将它与另一只鼠进行交配来确定转入基 因是否存在其生殖系中。 3）通过对子代进行杂交产生纯合的转基因 鼠(图124)。 图124 显微注射法获得的转基因鼠的纯合鼠系 ，转基因杂合鼠； 口，未转基因鼠 DNADNA显微注射法的评价显微注射法的评价(1)(1) 技术性很强，转基因动物的成功率低，通常发育成转基因 动物的受精卵一般占注射受精卵的5，而每1000个接受微注 射的受精卵里能产生30

15、50只转基因幼鼠。大多数情况下通 过微注射法获得转基因动物的成功率只有l/1000。有人用增 大微注射受精卵的数目来弥补缺陷。 对于显微注射用的DNA的要求高：1）转入的外源基因要能 够高效表达，2）可以诱导表达。3）具有帮助提高整合效率 的序列。在注射的载体中加上MAR序列(matrix attach region)，这种序列位于染色体的基部，具有隔离作用，可以 帮助基因高效表达。4） ，在外源基因两端可加入微卫星序 列，因在染色体上也有微卫星序列，两个微卫星序列可以帮 助发生同源重组，提高整合效率。 图125 用显微注射法获得的几种转基因动物的成活率 图126 转入基因的结构示意图。 DN

16、ADNA显微注射法的评价显微注射法的评价(2)(2) 由于微注射法所注射的DNA在宿主基因组中是随机整合 的，并且有可能发生多个拷贝插入同一位点的情况，因 此转入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中 ，从而干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常 发育和代谢； 另外，有的外源基因的表达具有时间性，得到的转基因 动物可能只在一段时期内表达外源基因；有些个体可能 因基因插入位点不合适而无法表达产物；还有些个体基 因拷贝数过多导致表达过量，干扰自身的正常生理活动 。 因此，并不是所有的转基因小鼠都能产生预期的性状。 由于这些原因，DNA微注射法的总效率还是比较低，但是 这种方法仍然是目前获得转基因鼠