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1、微生物工程复习资料微生物工程复习资料第一章 绪论1、 微生物工程：利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或把微生物直接作为生物反应器的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。2、 微生物工程的特点：优点（与化学工程相比）：1、生产过程通常在常温常压下进行，操作条件温和，不需考虑防爆问题。2、原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，没有精制的必要。3、生产过程是以生命体的自动调节方式进行的，因此多个反应就象一个反应一样，可在单一设备（发酵罐）中进行。4、能容易地生产复杂的高分子化合物，如酶、光学活性体等。5、能高度选择
2、性地进行复杂化合物在特定部位反应，如氧化、还原、官能团导入等。6、生产产品的生物体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质；除特殊情况外，培养液一般不会对人和动物造成危害。7、通过微生物菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃上升。例如青霉素的生产。面临的挑战：1、化学合成工业的竞争；2、农业生物工程的冲击。3、 发酵工业对微生物菌种的要求：1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高。2、可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高。3、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。4、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染
3、噬菌体。5、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。6、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。4、 发酵工程发展过程中几个标志性人物和事件：1）1680列文胡克 显微镜2）1857 巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起3）1897 毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶4）1905 科赫 固体培养基的发明，奠定了纯培养技术。5）1928 弗莱明发现青霉素6）1953 Watson 和Crick 双螺旋结构5、 发酵工程研究内容（5点）：1） 微生物菌株选育微生物菌株选育、改造与功能优化技术；2） 发酵工艺发酵过程优化、控制与反应器技术；3） 单元操作发
4、酵工程过程工程技术；4） 发酵产品分离提取工艺发酵产品高效提取技术与装备；5） 废物处理绿色制造工艺的开发。6、一般菌种分离纯化和筛选步骤：标本制备标本材料的预处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种包藏第二章 工业微生物菌种的选育及扩大培养1、 原生质体融合概念：就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。2、 原生质体育种技术主要有哪些：融合、转化技术、诱变技术3、 原生质体融合的方法和特点。方法：1）硝酸钠法；2）高钙离子法；3）PEG
5、法；4）多聚化合物法。特点：1）大幅度提高亲本之间重组频率；2）扩大重组的亲本范围；3）原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大；4）可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中；5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。4、 原生质体融合的基本工程（步骤）：5、 原生质体形成率和再审率（计算方法）：1）将用酶处理前的菌体经无菌水(或高渗溶液)系列稀释，涂布在完全培养基平板上培养，计出原菌数，该数值为A。2）将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程处理：用无菌水适当稀释，在完全培养基上培养
6、计数。由于原生质体在低渗透压下会破裂失活，所以长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数，该数值为B。用高渗透压液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和，该数值为C。原生质体形成率= 原生质体再生率=6、 菌种保藏原理及保藏方法：原理：主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。保藏方法：1）斜面冰箱保藏法；2）沙土管保藏法；3）菌丝速冻法；4）石蜡油封存法；5）真空冷冻干燥保藏法；6）液
7、氮超低温保藏法。7、 种子扩陪的概念，目的以及标准：种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。目的：（1）接种量的需要，抑制侵染；（2）缩短发酵周期；（3）逐级适应。标准：（1）生长活力强、同步性较好；（2）生理状态稳定，生产能力稳定；（3）总量及浓度满足要求；（4）无杂菌及噬菌体污染。8、 种子扩陪的过程（实验室，生产车间）：1）实验室阶段：培养物选择的原则：目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽孢的微生物，获
8、得一定数量和质量的菌体；对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。对于产孢子的微生物：获得一定数量和质量的孢子:培养步骤少,因而更容易获得量和质稳定的种子,但操作繁琐。获得一定数量和质量的菌丝体:便于操作,但需要更仔细的控制。培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。起始接种物的传代问题：目的：使菌种的传代次数尽可能的少。细菌 保藏斜面 活化斜面产孢子 保藏 母斜面 子斜面2）生产车间阶段
9、：培养物的选择原则：在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利：缩短发酵时间；有利于获得好的发酵结果。培养基选择的原则：目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本；二是驯化。发酵级数的确定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵发酵级数确定的依据：级数受
10、发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。接种量的确定：过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 种龄：种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度；质：形态(生长处于某个阶段、均匀等等)理化指标：
11、C、N、P的含量，pH，酶活等；无污染。9、 根据菌种特点，在实验室阶段，扩陪目的有所不同（对于产孢子与不产孢子而言）：1）对于不产孢子和芽孢的微生物获得一定数量和质量的菌体。2）对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子；获得一定数量和质量的菌丝体。10、关于菌种的异常分析：异常现象原因分析采取措施早期糖耗过慢、细胞生长缓慢接种孢子活力不够或接种量太少改善孢子制备过程早期糖耗过快、镜检有杂菌出现染菌分析感染原因，重新制种早期糖耗正常、细胞着色不深、有自溶现象、菌浓OD不再提高有可能出现噬菌体感染细胞生长过快，镜检正常接种量过大或溶氧过高镜检正常，考虑缩短种子培养时间繁殖菌丝不分散而聚团接入孢
12、子数以及通风搅拌效果欠佳加入某些表面活性剂促进菌丝分散，改善通风搅拌效果，如无法修正，重新制种菌丝粘附在罐壁上，最后易形成菌丝团搅拌效果不好，泡沫过多改善搅拌效果、加入适量的消泡剂、提高种子罐装料系数等第三章 培养基的设计与灭菌1、 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。2、 灭菌：是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。灭菌条件：121，20-30min。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。3、 除菌的
13、方法：培养基的加热灭菌、空气的过滤除菌、紫外线或电离辐射、化学药物灭菌4、 连续灭菌的流程与设备：（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070 C ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132C ）；3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；4）冷却管，使料液冷却到4050C后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。 注意：培养基连消时，发酵罐、加热塔、维持罐、冷却管要事先进行灭菌。5、 间歇灭菌与连续灭菌的比较优 点缺 点连续灭菌1.高温短时灭菌，培
14、养基 营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短， 利用率高。 1.设备复杂，操作麻烦, 染菌机会多。2.不适合含大量固体物 料的灭菌。间歇灭菌1.设备要求低，不需另外 加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批 量生产规模3.适合含大量固体物料的 灭菌1.培养基的营养物质损 失大，灭菌后培养基 质量下降2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产的 灭菌6、 空气除菌：空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 米。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m）。7、 空气除菌的方法：过滤除菌、热杀菌、试剂灭菌、辐射灭
15、菌8、 深层介质过滤的原理：微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。1、惯性冲击作用：2、拦截滞留作用：3、布朗扩散：1um 慢气流 不规则 直线运动4、重力沉降：重力 气流拖带力5、静电引力作用9、 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 ：空气空压机贮气罐冷却除油水加热（以上为空气预处理）总过滤器分过滤器无菌空气（以上为空气过滤）10、 发酵罐的特点：轴封严密，泄漏少；能承受一定压力、温度；搅拌通风装置保证气液充分混合；具有足够的冷却面积；死角少，灭菌彻底；适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）11、 发酵罐的类型：搅拌釜反应器、鼓泡式反应器、气升式反应器12、 培养基类型：1）按培养基成分：
