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1、流式细胞分选仪工作原理 陈邦添 13560461945 BchenB 内 容 流式的概念 流式的分析原理 流式数据解读 影响流式检测的因素 流式分选工作原理 流式的概念 细胞术检测经典方法 -荧光显微镜/激光共聚焦 优点：样本兼容性强，定性分析 缺点：分析速度慢，参数少，难以定量 流式细胞仪概念图 流式细胞仪通过检 测器接收激光照射 液流内细胞(或颗粒 )产生的光信号，经 过光电转换和统计 分析，从而反映细 胞物理化学特征和 细胞功能。 流式细胞术的特点 单细胞分析 分析速度快 多参数标记 结果客观 流式的检测对象 细胞 微藻 细菌 染色体 单个的生物颗粒、可溶性细胞因子等 流式细胞仪的检测内
2、容 细胞结构 =细胞大小 =细胞内粒度度 =DNA含量与细胞周期 =RNA含量 =蛋白质含量 细胞功能 =细胞表面/胞浆/核的特 异性抗原 =细胞活性 =细胞内细胞因子 =酶活性 =细胞受体 流式分析原理 流式细胞仪构造 液流系统 承载细胞快速流动 形成单细胞流 流体动力聚焦 光学系统 激光：信号激发 滤光片：光信号传递 检测器：信号接收 光信号检测 自发荧光 转 染 荧光标记 荧光信号 前向散射光(FS) 侧向散射光(SS) 散射光信号 散射光信号由细胞（颗 粒）本身及其内容物对 激光的折射产生，主要 反映了细胞（颗粒）的 物理特征如大小或内部 复杂程度。 散射光信号 散射光信号 前向散射光
3、(FS)侧向散射光(SS) 反映细胞大小反映细胞内部复杂程度 FS Sensor Laser 前向散射光 前向散射光（FS）信 号的反映细胞的大小 SS Sensor Laser 侧向散射光 侧向散射光（SS）信 号的反映细胞的颗粒度 Granulocytes Monocytes Lymphocytes RBCs, Debris, Dead Cells 可以根据细胞的大小和颗粒度这两个基本特征，对 细胞进行初步的分群和分类。 FS/SS 散点图 荧光信号 Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5) Laser 细胞受体/分子 核酸 (DNA/RNA
4、) 蛋白酶 染 色 体 基因表达 离子浓 度 细胞自身萤光或使用荧光染 料、荧光抗体标记，对细胞 的生物/化学指标进行检测 1) 抗原抗体结合（如表型测定，比如CD3-FITC） 2) 荧光素特异性结合（如周期测定，比如PI测定细胞周期） 3) 生物大分子之间的结合，如 PS 与ANNEXIN V的结合（ 凋亡测定） 4）通过相互作用引入荧光（FRET） 5）通过代谢不同对目标进行识别（SP染色） 6）通过电势能结合（膜电位测定） 让目标特异性带上荧光 荧光染料 EX EM 应用 荧光染料 EX EM 应用 激光器和荧光检测器的数目越多，选择越广 激光功率越大，激发效果越好。 荧光素选择 电子
5、系统 光电转换 数据处理 光电转换 Area/Lin 面积 High/Peak 峰高 Width 峰宽 Log (对数) Lin (线性) 流式分析流程 荧光素/抗体细胞 流式数据解读 流式图的解读 单参数-直方图： X轴表示荧光强度 Y轴表示频数 双参数-散点图： X轴与Y轴均表示荧光强度 一个点表示一个细胞 提供信息： 流式的结果图例 百分比 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例 绝对数 目标细胞的浓度 荧光强度 单个目标细胞上表达某种荧光素的多少 细胞相对大小 （单参数）直方图（双参数）散点图 影响流式检测的因素 样本制备 单细胞悬液的制备：物理法、酶解法 标本完整性（有无严重溶血或凝血
6、） 抗凝剂选择：EDTA（12-24h）、肝素(48-72h) 样本洗涤(wash or no-wash) 样本浓度 细胞活率 染色步骤（胞外 胞内） 影响流式结果的参数设置 阈值/触发信号（Threshold/Triger） 电压（Voltage）/ 增益（Gain） 荧光干扰（补偿 Compensate） 圈门&设门（Gate） 统计（Statistics） 阈值/触发信号（Threshold / Triger） 数据采集的前提条件所选择的信号被称为阈值或触发信号 阈值可以量化，大于该阈值的细胞信号才会被收集，以排除不必 要杂质的干扰 电压&增益 目的：调节检测器的信号扩增程度，信号随着电
7、压或增益的增加 而增强。 作用：通过电压及增益的调节区分信号强弱不同的细胞。 电压&增益增加，信号变强 ；反之，信号变弱。 电压调节 阴性对照（同型对照，空白对照）： 以阴性群完全出现，以正态分布为标准，调节 电压使阴性对照的本底荧光处于比较低的水 平。 荧光干扰（补偿 Compensate） 当细胞携带两种或两种以上的荧光素时，受到激光激发会发 射出两种或以上波长的荧光。 由于目前所使用的荧光染料发射谱较宽，虽然他们之间各自 发射峰值各不相同，弹发射谱范围有一定的重叠，会对其他 通道上的数值产生影响。 S I L E N T U N T O U C H A B L E U N T O U C
8、 H A B L E Untouchable = 其他染料没有干扰 (clean row) Silent = 不会漏进其他通道 (clean column) 补偿 矩阵 补偿调节 单染管（表达单一荧光的样本） 一定要使用阳性组，或阳性处理组，只有阴性群的样 本无法调节电压。可以使用VeserComp一类的自动捕 获抗体微球代替。 荧光补偿（Compensate） FITC单染 荧光补偿（Compensate） PE单染 验证 圈门&设门（Gate） 圈门是在流式图中根据需要圈定一群细胞。 设门是将门内的细胞应用在其他图中进行进一步的分 析。 门的种类很多，包括水平门、十字门、铰链门、多边 形们
9、、矩形门、椭圆型门等等。 圈门 设门（Gate） 流式分选 基于免疫荧光的单细胞分选 喷嘴 偏转板 液滴充电 + + + + - - - Drop Delay 废液口 Laser 细胞样本 细胞 Laser Delay 收集管 流式分选过程 影响分选的因素 细胞状态（细胞浓度、粘附性） 样本处理（染色、对照） 仪器条件（液滴形成，Drop Delay检测，断点维持） 分选操作（分选模式、阈值、设门） 实验样品的准备 样品浓度: 建议在 1-10 x106cells/ml 为避免样品聚集成团，上样前应用200目筛网过滤 粘附性强的细胞可考虑在培养液或PBS里加入BSA或 EDTA 死细胞过多考虑
10、应用PI/7-AAD等染料排除 仪器设置：液滴形成 液滴形成的要素： 喷嘴 振荡频率 压力 喷嘴选择 不同的细胞大小和细胞特性，理应选择不同规 格的喷嘴头，建议： 细胞应约为喷嘴直径的1/31/4 CytoNozzle MoFlo XDP：50(染色体，亚细胞结构), 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 m （大型真 菌、原生质体）； 细胞随机分布情况 200000 Hz 50000 ev/s 每4个液滴含有 1个细胞 200000 Hz 100000 ev/s 每2个液滴含有 1个细胞 200000 Hz 200000 ev/s 每个液滴含有1 个细胞 液滴形成率与
11、分选速度 震荡频率3倍细胞流速是高分选效率的保证。 频率和振幅的调节 液滴规则，断点清晰，间隔明显 Drop Delay检测和维持 延迟时间：影响分选纯度 断点位置：因此液滴延迟 液流稳定 常见因素： 管路中有气泡 环境温度过高 压力泵故障/漏气 解决方法： 提前换液/debubble 控制温度25 oC 查看压力表、管路接口 分选前应先观察断点液滴的位置，保证 30min内其位置不发生改变 分选模式 富集模式 所有带有阳性细胞的液滴都被分选 纯化模式 所有带有阴性细胞的液滴都放弃 单细胞模式 液滴里只有一个阳性细胞的被分选。 Positive cell Negative cell Droplets Cells Company Confidential 多群同时收集 Questions ？ Thank youThank you ！
