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1、常见罕见神经遗传病 基因检测平台的构建和应用 张旭 博士 航空医学研究所附属医院分子病理中心 2、疾病基因诊断数据分析原则 1、基因检测技术平台构建及质控 3、神经遗传代谢疾病基因检测 4、遗传性疾病产前诊断及应用 神经遗传疾病基因诊断及分析神经遗传疾病基因诊断及分析 人类基因组计划 人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美 国科学家于1985年率先提出，于 1990年正式启动的。目的是揭开 组成人体4万个基因的30亿个碱 基对的秘密。人类基因组研究的 一个关键应用是通过位置克隆寻 找未知生物化学功能的疾病基因 。 基因组医学时代的到来 v 临床基因检测资质：
2、合格的遗传诊断实验室，按照”1988年临床实验室 改进法案”(简称CLIA88)，凡医疗单位从事临床检测的实验室(如生 化诊断、血液诊断、传染病诊断、免疫诊断、病理诊断、超声诊断、放 射诊断、介入诊断、遗传诊断等)都要得到CLIA颁发的资格证书。并由 多个与医疗卫生事业相关的主管部门、执行机构、行业协会等共同组成 一个委员会(简称JCAHO)，每隔两年，对所有这些具临床检测资格的实 验室(如遗传诊断中的染色体诊断和基因诊断)进行检查、评审，其验收 合格者，继续颁发CLIA资格证书。少数非医疗单位的商业化基因诊断公 司，也可由行业协会(如美国病理学院，简称CAP，也是JCAHO的成员)按 CLI
3、A标准代为进行检查验收。没有CLIA资格证书的实验室虽然仍能开展 研究性质的基因诊断，但不能签发供临床使用的诊断报告，也不能从医 保机构、患者或被检测者收取诊断费用。 遗传病基因诊断-美国 v CLIA资质实验室质控：规定的质量控制、质量改进、质量保证等全方位 要求来设计、验证、改进适合于临床使用的基因诊断方法。例如，美国 政府的食品与药物管理局(FDA)己决定，对于按CLIA标准验收合格的基因 诊断实验室(CLIA实验室)所研究、开发、验证的基因诊断技术和方法， 不需要FDA的进一步审查或批准。 v 技术平台的合理性：技术方法应该尽可能达到经济实用、简便快速、高 通量自动化,以符合医学诊断的
4、规范化。所以，通过CLIA实验室的系统验 证，对于促进各类技术在临床基因诊断中的广泛应用是首要任务。 遗传病基因诊断-美国 遗传病基因诊断-欧洲 遗传病基因诊断-欧洲 v 欧洲的遗传诊断实验室。以国家标准化实验室为质量控制和资质发放单位，标准 化实验室制备各类需要基因检测项目的标准品供需要提供基因检测实验室作为临 床基因检测资质的检验指标。 遗传病的基因诊断-指南 EFNS（欧洲神经科学协会联盟） 针对神经遗传疾病分子诊断做出相应的指导 遗传病的基因诊断-诊治标准 遗传病的基因诊断-诊治标准 遗传病的基因诊断-诊治标准 遗传病的基因诊断-诊治标准 细胞遗传 检测平台 分子遗传 学平台 遗传信息
5、 技术平台 DHPLC 表观遗传 检测平台 Q-PCR 染色体核型 FISH 测序 遗传病的基因诊断-技术平台建立 遗传病临床基因检测的技术要求 通用性：全基因检测技术平台， 分子遗传，细胞遗传，分子肿瘤，病原微生物 检测； 分子生物学检测分类：DNA；Oligo；RNA； siRNA 分析和纯化； 基因突变检测；片段缺失；染色体多倍体和大 片段缺失检测；基因甲基化的检测；定量分析； 准确性：方法准确性 96%(未知突变)， 99%(已知突变) 质控性: 对PCR全过程的质量控制; 灵敏度：极低含量基因突变检测能力（极低含量基因突变检测能力（1:20001:2000 ） 高通量：检测能力达 2
6、000 PCR产物/天 简便性：DNA样品处理简单（PCR产物无需纯化，标记） 遗传病基因检测特色技术平台 DHPLC是根据在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差 异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性 条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源 双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。它是一种新型 基因突变筛查技术，既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR 引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。与传统的SSCP 、 DGGE等方法相比，DHPLC有较多
7、的优点。 主要应用：主要应用：1）已知和未知遗传变异的筛查 ； 2）单基因遗传病的基因诊断； 3 ）多基因遗传病的研究；4）癌症和肿瘤的筛查和诊断；5）基因甲基化异常疾病 的诊断。 变性高效液相色谱(DHPLC)技术 Heteroduplexes Direct Sequencing C/T C/T WAVE-HS DHPLC Analysis Wild-type Control 50% 20% 2% 0.5% 基因突变检测: 高灵敏度定量DNA突变检测 Detection of Mutation in APC MCR: Scanning for Minority Variants DHPLC技
8、术与直接测序技术突变检测比较 线粒体脑肌病基因检测 MELAS patient (muscle) heteroduplex MELAS patient (blood) heteroduplex normal DNA MERRF 8344 Heteroplasmy? 质质量差的OLIGO引物 (PAGE 纯纯化) 质质量好的OLIGO引物 (DHPLC 纯纯化) PCR所需引物 QAQC DHPLC技术对PCR引物QAQC Analysis of (NH2)- labeled, equal longth oligos with lnt difference 2002: (NH2)- tttttt
9、ttttggcctgatgaggagtactgg (30nt) 2002ag: (NH2)- ttttttttttggcctgatggggagtactgg (30nt) PCR引物,QRT-PCR探针,芯片探针QAQC DHPLC技术 对各类Oligo 探针的质量控制 DHPLC技术PCR产物质量控制 BRCA1 PCR片段质控 BRCA2 PCR片段质控 UK National Genetics Reference Laboratory 遗传信息技术平台 遗传病实验数据和结果分析 遗传信息技术平台 国际著名的生物信息中心 NCBI National Center for Biotechnol
10、ogy Information (US) EMBL European Molecular Biology Laboratory EBI European Bioinformatics Institute (EU) SIB Swiss Institute of Bioinformatics (Switzerland, ExPASy) HGMP Human Genome Mapping Project Resource Centre(UK) CMBI Centre of Molecular and Biomolecule (The Netherlands) ANGIS National Genom
11、e Information Service (Australia) NIG National Institute of Genetics (Japan) BIC National Bioinformatics Centre (Singapore) 杜氏肌营养不良（DMD） 数据库： http:/www.dmd.nl/nmdb/home.php?select_db=DMD I型神经纤维瘤（NF1） 数据库： http:/medgen.ugent.be/LOVD2/home.php?select_db=NF1_germline 脊髓性肌萎缩症SMA（SMN1） 数据库：http:/www.dmd.
12、nl/nmdb2/home.php?select_db=SMN1 异染性脑白质营养不良症（MLD） 数据库：http:/www.biochemgenetics.ca/asa/view.php Emery-Dreifuss肌营养不良 数据库：http:/www.umd.be 脆性X综合征（FMR1） 数据库：http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/MR/home.php?select_db=FMR1 家族性高钾型周期性麻痹（SCN4A） 数据库：http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=SCN4A 家族性ALS（SOD1）
13、数据库：http:/alsod.iop.kcl.ac.uk/Als/Overview/gene.aspx?gene_id=SOD1 常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病 (NOTCH3) 数据库：http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=NOTCH3 糖原累积症-GDSII（GAA） 数据库：http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=GAA 黏多糖贮积症II型（IDS ） 数据库：http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/MR/home.php?select_db
14、=IDS 马凡综合症（FBN1） 数据库：http:/www.umd.be/FBN1/ 先天性肌强直（CLCN1 ）数据库： http:/chromium.liacs.nl/LOVD2/home.php?select_db=CLCN1 先天性肾上腺皮质增生（CYP21A2） 数据库：http:/www.cypalleles.ki.se/ 遗传性痉挛性截瘫（HSP） 数据库：http:/www.hgmd.org/ http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/L1CAM/home.php?select_db=L1CAM http:/www.ngrl.org.uk/Manchester/
15、 早期帕金森症Parkin（PARK2） 数据库http:/grenada.lumc.nl/LOVD2/TPI/home.php?select_db=PARK2 遗传咨询遗传性痉挛截瘫HSP 数据库中有临床意义的DNA变异 遗传咨询遗传性痉挛截瘫HSP 遗传咨询杜氏肌营养不良DMD 数据库已有报导突变 数据库未报到新突变 遗传咨询杜氏肌营养不良DMD 遗传咨询杜氏肌营养不良DMD 数据库未报到新突变 遗传咨询遗传性痉挛截瘫HSP 数据库中没有临床意义的DNA变异 遗传咨询遗传性痉挛截瘫HSP 基因检测知情同意书 遗传病的基因诊断-应用 遗传病新概念 遗传病-细胞内遗传物质改变所引起的 疾病称遗
16、传病. v 单基因神经系统遗传病检测应用 v 单基因神经系统遗传病产前诊断 遗传病的基因诊断-应用 遗传遗传 性疾病分类类 神经经系统遗传统遗传 病 血液系统遗传统遗传 病 心脑脑血管系统遗传统遗传 病 泌尿系统遗传统遗传 病 内分泌系统遗传统遗传 病 骨骼系统遗传统遗传 病 生殖系统遗传统遗传 病 眼部遗传遗传 性疾病 皮肤遗传遗传 性基因 耳鼻喉遗传遗传 性基因 出生缺陷 精神性遗传遗传 病 遗传病的基因诊断-SMA v脊髓性肌肉萎缩症(SMA)是儿童发生率第二高的 常染色体隐性遗传疾病，其新生儿发病率大约是 1/6000-1/10000，基因携带率大约是1-3 %。 v目前已知造成此症的原因主要是与位于第五条染 色体5q11.2-13.3区域的基因有关。在这个区域中 ，包含了一组呈镜向对称重复
